نموذج الأمعاء على رقاقة لدراسة محور ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي
Summary
neuroHuMiX هو نموذج متقدم للأمعاء على رقاقة لدراسة تفاعلات الخلايا البكتيرية والظهارية والخلايا العصبية في ظل ظروف الزراعة المشتركة القريبة والتمثيلية. يسمح هذا النموذج بكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاتصال بين ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي.
Abstract
يتم استعمار جسم الإنسان من قبل نفس العدد على الأقل من الخلايا الميكروبية التي تتكون من الخلايا البشرية ، وتقع معظم هذه الكائنات الحية الدقيقة في الأمعاء. على الرغم من أن التفاعل بين ميكروبيوم الأمعاء والمضيف قد تمت دراسته على نطاق واسع ، إلا أن كيفية تفاعل ميكروبيوم الأمعاء مع الجهاز العصبي المعوي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. حتى الآن ، لا يوجد ممثل فسيولوجي في نموذج المختبر لدراسة تفاعلات ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي.
لسد هذه الفجوة ، قمنا بتطوير نموذج الحديث المتبادل بين الإنسان والميكروبات (HuMiX) من خلال إدخال الخلايا العصبية المعوية المستحثة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات في الجهاز. يسمح النموذج الناتج ، “neuroHuMiX” ، بالزراعة المشتركة للخلايا البكتيرية والظهارية والعصبية عبر قنوات الموائع الدقيقة ، مفصولة بأغشية شبه منفذة. على الرغم من فصل أنواع الخلايا المختلفة ، يمكن للخلايا التواصل مع بعضها البعض من خلال عوامل قابلة للذوبان ، مما يوفر في نفس الوقت فرصة لدراسة كل نوع من أنواع الخلايا على حدة. يسمح هذا الإعداد برؤى أولية حول كيفية تأثير ميكروبيوم الأمعاء على الخلايا العصبية المعوية. هذه خطوة أولى حاسمة في دراسة وفهم محور ميكروبيوم الأمعاء البشرية والجهاز العصبي.
Introduction
يلعب ميكروبيوم الأمعاء البشرية دورا حاسما في صحة الإنسان ومرضه. لقد تمت دراسته على نطاق واسع على مدى العقد ونصف العقد الماضيين ، وتم الآن تأسيس دوره المحتمل في تعديل الصحة والمرض1. تم افتراض حدوث اضطراب في الميكروبيوم يؤدي إلى مجتمع ميكروبي غير متوازن (dysbiosis) للمشاركة في التسبب في العديد من الاضطرابات المزمنة ، مثل السمنة ومرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون والمستقيم ، أو حتى الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون 2,3.
على الرغم من أن ميكروبيوم الأمعاء البشرية قد ارتبط بالحالات العصبية ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح كيف يتواصل ميكروبيوم الأمعاء مع الجهاز العصبي المعوي ويؤثر عليه. نظرا لأنه لا يمكن الوصول بسهولة إلى الجهاز العصبي المعوي البشري للدراسة الفورية ، فقد تم استخدام النماذج الحيوانية في التجارب حتى الآن4. ومع ذلك ، نظرا للاختلافات الواضحة بين النماذج الحيوانية والبشر5 ، فإن تطوير نماذج في المختبر تحاكي الأمعاء البشرية له أهمية فورية. في هذا السياق ، سمح لنا المجال المزدهر والمتقدم للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) بالحصول على الخلايا العصبية المعوية التمثيلية (ENs)6. تسمح ENs المشتقة من iPSC بدراسة الجهاز العصبي المعوي في نماذج الثقافة المختبرية ، مثل إدخالات زراعة الخلايا أو المواد العضوية أو الأعضاء على رقاقة 7,8.
نموذج الحديث المتبادل بين الإنسان والميكروبات (HuMiX) هو نموذج القناة الهضمية على رقاقة يحاكي القناة الهضميةالبشرية 9. استوعب نموذج HuMiX الأولي (المشار إليه فيما يلي باسم الجهاز الأولي) الخلايا الظهارية (Caco-2) والخلايا البكتيرية10,11. ومع ذلك ، لدراسة ارتباط ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي ، تم أيضا إدخال ENs6 المشتقة من iPSC في النظام (الشكل 1). تسمح الثقافة المشتركة القريبة للخلايا العصبية والظهارية والبكتيرية بتحليل أنواع الخلايا المختلفة بشكل فردي ودراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة في بيئة تحاكي بيئة الأمعاء البشرية.
في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم في تطوير نماذج لدراسة الأعضاء بطرق أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية باستخدام نماذج الأعضاء على رقاقة (على سبيل المثال ، الأمعاء على رقاقة). هذه النماذج أكثر تمثيلا لبيئة الأمعاء البشرية بسبب الإمداد المستمر بالمغذيات وإزالة النفايات ، بالإضافة إلى المراقبة في الوقت الفعلي ، على سبيل المثال ، لمستويات الأكسجين أو سلامة الحاجز 8,12. تسمح هذه النماذج على وجه التحديد بدراسة آثار بكتيريا الأمعاء على الخلايا المضيفة. ومع ذلك ، لتكون قادرا على استخدام الأعضاء على رقاقة لدراسة العلاقات المتبادلة بين ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي ، يجب دمج الخلايا العصبية في مثل هذه الأنظمة. لذلك ، كان الهدف من مواصلة تطوير HuMiX وإنشاء نظام neuroHuMiX (المشار إليه فيما يلي باسم الجهاز) هو تطوير نموذج الأمعاء على رقاقة ، والذي يتضمن الخلايا العصبية المعوية في الثقافة المشتركة القريبة مع الخلايا الظهارية المعوية والبكتيريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثبت الآن أن ميكروبيوم الأمعاء البشرية يؤثر على صحة المضيف ومرضه. على الرغم من المعرفة التي تشير إلى أهمية الميكروبيوم لدينا ، وخاصة في الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر أو مرض باركنسون3،13 ، لا يزال من غير المعروف إلى حد كبير كيف يتفاعل ميكروبيوم الأمعاء مع الجهاز العصبي المعوي ، وبعد ذلك ، مع الدماغ.
لم يتوفر حتى الآن نموذج تمثيلي لدراسة التفاعلات بين ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي. تم إجراء الدراسات المتعلقة بمحور الأمعاء والدماغ تقليديا باستخدام نماذج الفئران13. تشترك الفئران والبشر في 85٪ من تسلسلاتهم الجينومية14 ، ولكن هناك اختلافات كبيرة يجب مراعاتها عند مقارنة الفئران بالبشر. فيما يتعلق بالقناة الهضمية ، من المهم ملاحظة أنه بالمقارنة مع البشر ، فإن الفئران هي عاشبة حصرية. نتيجة لذلك ، يختلف الجهاز الهضمي في الطول والخصائص ، مثل “إفراغ المعدة”14. تظهر أدمغة الفئران أيضا اختلافات مهمة ، حيث يختلف الهيكل العام بين الفئران والبشر15. الأهم من ذلك ، أن البشر لديهم أوقات أطول لدورة الخلايا من الأسلاف العصبية15. وبالتالي ، من المهم تطوير نماذج تمثيلية تشمل الخلايا المشتقة من الإنسان ، بما في ذلك الخلايا المعوية والعصبية5. في هذا السياق ، فإن تطوير المزيد من النماذج البحثية القابلة للتكرار عبر المختبر يقلل من الحاجة إلى استخدام النماذج الحيوانية ويحسن قابلية التكاثر.
neuroHuMiX هو نسخة متقدمة من طراز HuMiX السابق9. HuMiX هو نموذج القناة الهضمية على رقاقة يسمح بالثقافات المشتركة القريبة والتمثيلية للخلايا الظهارية والبكتيرية. الاتصال بين الخلايا والخلايا ممكن من خلال الزراعة المشتركة القريبة ونشر العوامل المفرزة والمستقلبات عبر الأغشية شبه المنفذة. ومع ذلك ، لتوسيع فائدة الجهاز الأولي لدراسة بيئة الأمعاء البشرية ، يلزم إدخال نوع إضافي من الخلايا. لمعالجة هذا الأمر ، يتيح neuroHuMiX ، الذي تم تطويره مع إدخال ENs المشتقة من iPSC ، زراعة مشتركة قريبة للبكتيريا والخلايا الظهارية المعوية و ENs. يسمح لنا النموذج الناتج في المختبر بمعالجة الأسئلة المتعلقة بميكروبيوم الأمعاء البشرية فيما يتعلق بالجهاز العصبي البشري. يواجه الاستزراع المشترك لأنواع مختلفة من الخلايا ، وخاصة المزارع المشتركة لخلايا الثدييات والبكتيريا ، العديد من التحديات ، بما في ذلك فقدان الصلاحية ، وضعف الالتصاق ، والخسارة الإجمالية في التقاء16. هنا ، أثبتنا أنه داخل هذا الجهاز ، نحن قادرون على المشاركة في زراعة ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا داخل نفس النظام مع الحفاظ على صلاحية الخلية عالية.
تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في ضمان التقاء الخلايا العصبية – 80٪ -90٪ من التقاء الخلايا وصلاحيتها – قبل التلقيح في الجهاز. نظرا لأنه من غير الممكن تقييم نمو الخلايا أثناء الجري ، فمن الأهمية بمكان التأكد من أن الخلايا متقاربة وتنمو بشكل جيد قبل إدخالها في النموذج. في حين أن هذا قد يكون عاملا مقيدا ، إلا أن الجدوى العامة والالتقاء الملاحظ داخل الجهاز مرتفعان بشكل عام.
يتم توصيل الجهاز عبر خطوط الأنابيب بمضخة تمعجية. كل غرفة خلية لها خط أنابيب خاص بها. يتكون الأنبوب من أنبوب مضخة يسمح باستخدام مضخة تمعجية لتروية الوسط ، بالإضافة إلى أنبوب يربط أنبوب المضخة بالجهاز وأنبوب يربط الجهاز بزجاجات التدفق / النفايات. يتم تضمين منافذ أخذ العينات قبل الجهاز وبعده ، للسماح بتلقيح وأخذ عينات من وسط التدفق الخارجي. يمكن توصيل كل غرفة بوسط مختلف ، مما يتيح أفضل ظروف الثقافة لكل نوع من أنواع الخلايا الفردية. يمكن فتح أو إغلاق كل غرفة حسب الاحتياجات المحددة للإمداد المتوسط. في الجهاز ، تظل الغرفة العصبية مغلقة لمعظم التجربة ، في حين أن الغرف البكتيرية والظهارية مفتوحة طوال الوقت ، مما يعني أنها تحصل على وسط جديد طوال فترة التجربة بأكملها. للتأكد من تدفق الوسيط دون انقطاع ، من الضروري عدم ترك أي هواء في الأنابيب أو الموصلات أو في الجهاز. لذلك ، من المهم أولا ترك الأجهزة تعمل لبضع دقائق في خطوة التحضير. هذا غالبا ما يحل المشكلة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن إغلاق أحد الخطوط الأخرى التي تنخفض لفترة قصيرة من الوقت عن طريق إغلاق المحبس ثلاثي الاتجاهات للتدفق الخارجي. يؤدي هذا إلى إعادة توجيه الوسيط إلى الخط مع فقاعة الهواء ، وبالتالي حل المشكلة عن طريق دفع الفقاعة للخارج عبر الأنبوب.
بالنسبة لأي تجربة لزراعة الخلايا ، يعد الوسط مكونا رئيسيا ، حيث يكون لكل نوع خلية وسطه الخاص. في إعداد الثقافة المشتركة ، يجب أن يكون الوسيط متوافقا ليس فقط مع نوع الخلية الذي ينمو فيه ، ولكن أيضا مع أنواع الخلايا الأخرى داخل الثقافة المشتركة. لا يختلف هذا بالنسبة للجهاز ، مما يشكل تحديا إضافيا حيث لدينا ثلاث حجرات مختلفة مع ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا داخل الخلايا البكتيرية والظهارية والعصبية. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أنه من خلال تعديل الوسائط البكتيرية – مع إضافة 5٪ MRS إلى RPMI 1640 مع 10٪ FBS – يمكن زراعة جميع أنواع الخلايا ، وخاصة الخلايا البكتيرية والظهارية ، بنجاح داخل النظام. ومع ذلك ، في الجهاز ، يتم زراعة أنواع مختلفة من الخلايا بشكل قريب ، وبالتالي فهي ليست على اتصال مباشر مع بعضها البعض. على الرغم من أن هذا لا يمثل تماما الاتصال المباشر بين الخلايا في الأمعاء البشرية ، وبالتالي فهو قيد ، فإن حالة الثقافة المشتركة القريبة والتمثيلية هي قوة للتحليلات النهائية. تبادل العوامل القابلة للذوبان بين الغرف المختلفة وأنواع الخلايا. ومن ثم ، لا تزال الخلايا تتفاعل مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقيقة أنه يمكن حصاد أنواع الخلايا وتحليلها بشكل منفصل تسمح لنا بدراسة تأثير الميكروبيوم الصحي و / أو المريض على أنواع الخلايا المختلفة (بما في ذلك الخلايا العصبية) وبالتالي تحديد / استرداد القراءات الخاصة بنوع الخلية. هناك قيد آخر وهو أنه لا يمكن متابعة مورفولوجيا الخلايا أثناء التشغيل التجريبي ، حيث لا يمكن فتح الجهاز إلا وفحص الخلايا في نهاية كل تجربة.
على حد علمنا ، فإن neuroHuMiX هو أول نموذج للأمعاء على رقاقة بما في ذلك ENs. هذه خطوة نحو توضيح التواصل بين ميكروبيوتا الأمعاء والجهاز العصبي المعوي. إنه نموذج يسمح بالتحقيق في التفاعل بين الأنواع البكتيرية والطبقة الظهارية و ENs. يسمح لنا تصميمه بدراسة تبادل العوامل القابلة للذوبان التي تفرزها أنواع الخلايا المختلفة وتأثيرها على بعضها البعض. من الآن فصاعدا ، سيكون من المهم ليس فقط وجود ENs مشتقة من iPSC ، ولكن أيضا الخلايا الظهارية المشتقة من iPSC داخل الجهاز ، لنقل الجهاز إلى نموذج مخصص. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج الشخصي لاختبار ما قبل ومؤيد و synbiotics 10,11 وربما تطوير الفحص الشخصي والأساليب العلاجية17. يمكن أن يلقي NeuroHuMiX الشخصي الضوء في النهاية على “المادة المظلمة” لميكروبيوم الأمعاء البشرية وتفاعلاته مع الجهاز العصبي على طول محور ميكروبيوم الأمعاء والجهاز العصبي ، مما يمهد الطريق للتقييم والتدخلات العلاجية.
يمكننا أن نستنتج أن القدرة على الحصول على أمعاء على رقاقة بما في ذلك الجهاز العصبي المعوي أمر بالغ الأهمية للتقدم في دراسة وفهم التفاعلات على طول محور الجهاز العصبي لميكروبيوم الأمعاء. يسمح لنا NeuroHuMiX بدراسة تأثيرات الأنواع البكتيرية على الخلايا المضيفة ويوفر لنا أساسا جيدا لتحسين النموذج بشكل أكبر بطريقة أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جاريد ستيرنيكرت على تزويدنا بالخلايا من خط K7. نود أيضا أن نشكر المتعاونين منذ فترة طويلة الدكتور فريدريك زينهاوزر وماثيو دبليو باريت من جامعة أريزونا على مساعدتهم في الجوانب الهندسية. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا للدكتورة فالنتينا غالاتا لمساعدتها في تصميم التمثيل التخطيطي ل neuroHuMiX. تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة 863664). تم إنشاء الشكل 1 جزئيا باستخدام Biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
References
- Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. Human gut microbiome: function matters. Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).
- Toor, D., et al. Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432 (2019).
- Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner’s and Auerbach’s plexuses in cases staged for Parkinson’s disease-related brain pathology. Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).
- Schmit, K. J., et al. Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson’s disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse. bioRxiv. , (2022).
- Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research. Microbiome. 1 (1), 14 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Wu, Q., et al. Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects. BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9 (2020).
- May, S., Evans, S., Parry, L. Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota. Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Greenhalgh, K., et al. Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells. Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).
- Mao, J. H., et al. Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory. Microbiome. 8 (1), 53 (2020).
- Moysidou, C. M., Owens, R. M. Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro. Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).
- Kim, S., et al. Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson’s disease. Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Marshall, J. J., Mason, J. O. Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease. Brain Research. 1724, 146427 (2019).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Sedrani, C., Wilmes, P. Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening. Cell Reports Methods. 2 (1), 100139 (2022).
