Ube3a Varyantlarının İşlevsel Değerlendirmesi için Ölçeklenebilir, Hücre Tabanlı Bir Yöntem
Summary
Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a’daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.
Abstract
Tıpta dizilemenin artan kullanımı, insan genomunda milyonlarca kodlama varyantı tanımlamıştır. Bu varyantların birçoğu nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genlerde görülür, ancak varyantların büyük çoğunluğunun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Mevcut protokol, hem otizm hem de Angelman sendromuna bağlı bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a için varyantların incelenmesini açıklamaktadır. Ube3a’nın çoğaltılması veya çoğaltılması otizmle güçlü bir şekilde bağlantılıdır, oysa silinmesi Angelman sendromuna neden olur. Bu nedenle, UBE3A protein aktivitesindeki değişikliklerin değerini anlamak, klinik sonuçlar için önemlidir. Burada, Ube3a varyantlarını bir Wnt yol muhabiri ile eşleştiren hızlı, hücre tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit tahlil ölçeklenebilir ve herhangi bir Ube3a varyantındaki aktivite değişikliklerinin değerini ve büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemin tesisi, UBE3A’nın enzimatik mekanizmaları hakkında derin bilgiler edinmek için kullanılabilecek çok sayıda yapı-işlev bilgisinin üretilmesine izin verir.
Introduction
Son teknolojik gelişmeler, ekzomların ve genomların dizilimini klinik ortamlarda rutin hale getirmiştir 1,2. Bu, tipik olarak bir proteindeki bir amino asidi değiştiren milyonlarca yanlış anlam varyantı da dahil olmak üzere çok sayıda genetik varyantın keşfedilmesine yol açmıştır. Bu varyantların fonksiyonel önemini anlamak bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bilinen yanlış anlam varyantlarının sadece küçük bir kısmı (~% 2) klinik bir yoruma sahiptir 1,3.
Bu sorunun belirgin bir örneği, yıkım için substrat proteinlerini hedef alan bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a’dır 4. Ube3a, kromozom 15q11-13 içinde bulunur ve sadece maternal kalıtsal alel 5,6,7’den eksprese edilir. Hastalık genetiğinden yapılan gözlemler, UBE3A enziminin yetersiz veya aşırı aktivitesinin farklı nörogelişimsel bozukluklara neden olduğunu kuvvetle göstermektedir. Maternal kromozom 15q11-13’ün silinmesi, ciddi zihinsel engellilik, motor bozukluklar, nöbetler, sık sık gülümseyen mutlu bir tavır ve dismorfik yüz özellikleri 8,9,10 ile karakterize bir bozukluk olan Angelman sendromuna (AS) 8’e neden olur. Buna karşılık, maternal kromozom 15q11-13’ün çoğaltılması veya çoğaltılması, otizmin en yaygın sendromik formlarından biri olarak kabul edilen heterojen bir durum olan Dup15q sendromuna neden olur11,12,13. Ek olarak, Ube3a’da tanımlanan yüzlerce yanlış anlam varyantı vardır, bunların çoğu, fonksiyonel ve klinik önemi bilinmediğinden, belirsiz öneme sahip varyantlar (VUS) olarak kabul edilir. Bu nedenle, nörogelişimsel hastalığa katkıda bulunup bulunmadıklarını belirlemek için Ube3a varyantlarını ampirik olarak değerlendirebilecek yöntemler geliştirmeye büyük ilgi vardır.
UBE3A enzimi, E2 enzimlerinden aktive ubikitini kabul etmek ve substrat proteinlerine aktarmak için gerekli biyokimyasal makineleri içeren isimsiz HECT alanına sahip olan E3 ubikitin ligazlarının HECT (E6-AP C-terminus’a homolog) alan ailesine aittir14. Tarihsel olarak, E3 enzimlerinin karakterizasyonu,saflaştırılmış proteinlerin bir topluluğunu gerektiren yeniden yapılandırılmış in vitro sistemlere dayanmaktadır 4,15,16. Bu tür yöntemler yavaş ve emek yoğundur ve çok sayıda varyantın aktivitesini değerlendirmeye uygun değildir. Önceki çalışmalarda, UBE3A’nın, β-katenin17’nin bozulmasını yavaşlatmak için proteazomun işlevini modüle ederek HEK293T hücrelerinde Wnt yolunu aktive ettiği tespit edildi. Bu içgörü, Wnt yol muhabirlerinin Ube3a18’in hem işlev kaybı hem de kazanç değişkenlerini tanımlamak için verimli ve hızlı bir yöntem olarak kullanılmasına izin verir. Aşağıdaki protokol, Ube3a varyantlarının aktivitesindeki değişiklikleri değerlendirmek için Lusiferaz tabanlı bir muhabirin yanı sıra Ube3a varyantlarını üretmek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, Ube3a varyantlarının enzimatik aktivitesini değerlendirmek için verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlili kullanırken dikkatli bir şekilde düşünülmesini gerektiren birkaç teknik ayrıntı vardır. Bir husus, bu tahlilde kullanılan Wnt muhabir plazmidlerinin seçimidir. Burada açıklanan protokol, özellikle TCF bağlanma bölgelerinin rekombinasyonunu ve kaybını en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış bağlayıcı dizileriyle ayrılmış 12 T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Simons Vakfı Bağımsızlık Köprüsü Ödülü (SFARI Ödülü #387972; J.J.Y.), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı’ndan (J.J.Y.) NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Alfred P. Sloan Vakfı’ndan (J.J.Y.) Araştırma Bursu ve Angelman Sendromu Vakfı (J.J.Y.), Whitehall Vakfı (J.J.Y.) ve NIMH’den (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
