Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a
Summary
Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.
Abstract
El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.
Introduction
Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos 1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica 1,3.
Un ejemplo destacado de este problema es Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 que se dirige a las proteínas de sustrato para su degradación4. Ube3a reside dentro del cromosoma 15q11-13 y se expresa exclusivamente a partir del alelo heredado materno 5,6,7. Las observaciones de la genética de la enfermedad sugieren fuertemente que la actividad insuficiente o excesiva de la enzima UBE3A causa distintos trastornos del desarrollo neurológico. La deleción del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Angelman (EA)8, un trastorno caracterizado por discapacidad intelectual grave, deficiencias motoras, convulsiones, un comportamiento feliz con sonrisas frecuentes y rasgos faciales dismórficos 8,9,10. En contraste, la duplicación o triplicación del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Dup15q, una condición heterogénea reconocida como una de las formas sindrómicas más prevalentes de autismo11,12,13. Además, hay cientos de variantes sin sentido identificadas en Ube3a, la mayoría de las cuales se consideran variantes de significado incierto (VUS) ya que su significado funcional y clínico son desconocidos. Por lo tanto, existe un interés considerable en desarrollar métodos que puedan evaluar empíricamente las variantes de Ube3a para determinar si contribuyen a la enfermedad del desarrollo neurológico.
La enzima UBE3A pertenece a la familia de dominios HECT (homólogos a E6-AP C-terminal) de ligasas de ubiquitina E3 que poseen el dominio HECT del mismo nombre, que contiene la maquinaria bioquímica necesaria para aceptar ubiquitina activada de enzimas E2 y transferirla a proteínas sustrato14. Históricamente, la caracterización de las enzimas E3 se ha basado en sistemas in vitro reconstituidos que requieren un conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tales métodos son lentos y requieren mucha mano de obra y no son susceptibles de evaluar la actividad de un gran número de variantes. En trabajos anteriores, se identificó UBE3A para activar la vía Wnt en las células HEK293T mediante la modulación de la función del proteasoma para ralentizar la degradación de la β-catenina17. Esta información permite el uso de reporteros de la vía Wnt como un método eficiente y rápido para identificar variantes de pérdida y ganancia de función de Ube3a18. El siguiente protocolo describe en detalle un método para generar variantes de Ube3a, así como un reportero basado en luciferasa para evaluar los cambios en la actividad de las variantes de Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)21, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un Premio Puente a la Independencia de la Fundación Simons (Premio SFARI # 387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), una beca de investigación de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), y becas de investigación de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), la Whitehall Foundation (J.J.Y.) y el NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
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