Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法
Summary
機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している 遺伝子であるUbe3aのミスセンスバリアントの機能的重要性を評価するために、簡単でスケーラブルな方法が開発されました。
Abstract
医学におけるシーケンシングの使用の増加により、ヒトゲノムに何百万ものコーディングバリアントが特定されました。これらの変異体の多くは神経発達障害に関連する遺伝子に存在しますが、大多数の変異体の機能的重要性は不明のままです。本プロトコルは、自閉症およびアンジェルマン症候群の両方に関連するE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子である Ube3aの変異体の研究を記載している。 Ube3a の重複または三重化は自閉症と強く関連していますが、その欠失はアンジェルマン症候群を引き起こします。したがって、UBE3Aタンパク質活性の変化の価数を理解することは、臨床転帰にとって重要です。ここでは、 Ube3a 変異体とWnt経路レポーターをペアにする迅速な細胞ベースの方法について説明する。この単純なアッセイはスケーラブルであり、任意の Ube3a 変異体の活性変化の価数と大きさを決定するために使用できます。さらに、本手法の設備により、豊富な構造機能情報の生成が可能となり、UBE3Aの酵素機構を深く理解することができます。
Introduction
最近の技術の進歩により、臨床現場ではエクソームとゲノムの配列決定が日常的になっています1,2。これにより、タンパク質中の1つのアミノ酸を通常変化させる数百万のミスセンス変異を含む、多数の遺伝的変異が発見されました。これらの変異体の機能的意義を理解することは依然として課題であり、既知のミスセンス変異体のごく一部(~2%)のみが臨床的解釈を持っています1,3。
この問題の顕著な例は、分解のために基質タンパク質を標的とするE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるUbe3aです4。Ube3aは染色体15q11-13内に存在し、母性遺伝対立遺伝子5,6,7からのみ発現します。疾患遺伝学からの観察は、UBE3A酵素の不十分または過剰な活性が明確な神経発達障害を引き起こすことを強く示唆しています。母体の染色体15q11-13の欠失は、重度の知的障害、運動障害、発作、頻繁な笑顔を伴う幸せな態度、および異形性顔の特徴を特徴とする障害であるアンジェルマン症候群(AS)8を引き起こします8,9,10。対照的に、母体の染色体15q11-13の重複または三重化は、自閉症の最も一般的な症候群形態の1つとして認識されている不均一な状態であるDup15q症候群を引き起こします11,12,13。さらに、Ube3aでは何百ものミスセンスバリアントが特定されており、その大部分は機能的および臨床的意義が不明であるため、重要性が不確実なバリアント(VUS)と見なされます。したがって、Ube3a変異体を経験的に評価して、それらが神経発達疾患に寄与するかどうかを判断する方法の開発には大きな関心が寄せられています。
UBE3A酵素は、E3ユビキチンリガーゼのHECT(E6-AP C末端に相同)ドメインファミリーに属し、すべてがE2酵素から活性化されたユビキチンを受け入れて基質タンパク質に転移するために必要な生化学的機構を含む同名のHECTドメインを有する14。歴史的に、E3酵素の特性評価は、精製タンパク質のアンサンブルを必要とする再構成されたin vitroシステムに依存してきました4,15,16。そのような方法は遅くそして労働集約的でありそして多数の変種の活性を評価するのには適していない。以前の研究では、UBE3Aは、プロテアソームの機能を調節してβ-カテニン17の分解を遅らせることにより、HEK293T細胞のWnt経路を活性化することが特定されました。この洞察により、Ube3a18の機能喪失変異体と機能獲得変異体の両方を特定するための効率的かつ迅速な方法としてWnt経路レポーターを使用できます。以下のプロトコルは、Ube3a変異体を生成する方法、ならびにUbe3a変異体の活性の変化を評価するためのルシフェラーゼベースのレポーターについて詳細に説明している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、Ube3a変異体の酵素活性を評価するための効率的でスケーラブルな方法を提供します。このアッセイを使用する際には、慎重な検討を必要とするいくつかの技術的な詳細があります。1つの考慮事項は、このアッセイで使用されるWntレポータープラスミドの選択です。ここで説明するプロトコルは、組換えとTCF結合部位の喪失を最小限に抑えるために特別に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、サイモンズ財団の独立への橋渡し賞(SFARI賞#387972;J.J.Y.)、脳と行動研究財団(JJY)からのNARSAD若手研究者賞、アルフレッドP.スローン財団(JJY)からの研究フェローシップ、およびアンジェルマン症候群財団(J.J.Y)、ホワイトホール財団(J.J.Y.)、およびNIMH(R01MH122786;J.J.Y.)。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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