שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a
Summary
שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג’למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.
Abstract
השימוש המוגבר בריצוף ברפואה זיהה מיליוני גרסאות קידוד בגנום האנושי. רבים מהווריאנטים האלה מתרחשים בגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אך המשמעות התפקודית של הרוב המכריע של הווריאנטים עדיין לא ידועה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של וריאנטים עבור Ube3a, גן המקודד E3 יוביקוויטין ליגאז הקשור הן לאוטיזם והן לתסמונת אנג’למן. שכפול או משולש של Ube3a קשור מאוד לאוטיזם, ואילו מחיקתו גורמת לתסמונת אנג’למן. לפיכך, הבנת הערכיות של שינויים בפעילות החלבון UBE3A חשובה לתוצאות קליניות. כאן מתוארת שיטה מהירה, מבוססת תאים, המשלבת גרסאות Ube3a עם כתב מסלול Wnt. בדיקה פשוטה זו ניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הערכיות ואת גודל השינויים בפעילות בכל גרסה של Ube3a . יתר על כן, המתקן של שיטה זו מאפשר יצירת שפע של מידע מבנה-פונקציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות עמוקות על מנגנונים אנזימטיים של UBE3A.
Introduction
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הפכה את ריצוף האקסומים והגנומים לשגרתי במסגרות קליניות 1,2. זה הוביל לגילוי של מספר רב של וריאנטים גנטיים, כולל מיליוני וריאנטים של מיסנס שבדרך כלל משנים חומצת אמינו אחת בחלבון. הבנת המשמעות הפונקציונלית של וריאנטים אלה נותרה אתגר, ורק לחלק קטן (~2%) מהווריאנטים הידועים של מיסנס יש פרשנות קלינית 1,3.
דוגמה בולטת לבעיה זו היא Ube3a, גן המקודד יוביקוויטין ליגאז E3 המכוון לחלבוני סובסטרט לפירוק4. Ube3a שוכן בתוך כרומוזום 15q11-13 ומתבטא אך ורק באלל 5,6,7 שעבר בירושה אימהית. תצפיות מהגנטיקה של מחלות מצביעות על כך שפעילות לא מספקת או מוגזמת של האנזים UBE3A גורמת להפרעות נוירו-התפתחותיות מובהקות. מחיקת כרומוזום אימהי 15q11-13 גורמת לתסמונת אנג’למן (AS)8, הפרעה המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית קשה, ליקויים מוטוריים, התקפים, התנהגות שמחה עם חיוך תכוף, ותווי פנים דיסמורפיים 8,9,10. לעומת זאת, שכפול או שילוש של כרומוזום אימהי 15q11-13 גורם לתסמונת Dup15q, מצב הטרוגני המוכר כאחת הצורות הסינדרומיות הנפוצות ביותר של אוטיזם11,12,13. בנוסף, ישנם מאות וריאנטים שגויים שזוהו ב– Ube3a, שרובם נחשבים לווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה (VUS) מכיוון שמשמעותם התפקודית והקלינית אינה ידועה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח שיטות שיכולות להעריך באופן אמפירי גרסאות Ube3a כדי לקבוע אם הם תורמים למחלות נוירו-התפתחותיות.
האנזים UBE3A שייך למשפחת התחום HECT (הומולוגית ל-E6-AP C-terminus) של ליגאזות יוביקוויטין E3 שכולן מחזיקות בתחום ה-HECT המפורסם, המכיל את המנגנון הביוכימי הדרוש כדי לקבל יוביקוויטין פעיל מאנזימי E2 ולהעבירו לחלבוני סובסטרט14. מבחינה היסטורית, האפיון של אנזימי E3 הסתמך על מערכות מבחנה משוחזרות הדורשות אנסמבל של חלבונים מטוהרים 4,15,16. שיטות כאלה הן איטיות ועתירות עבודה ואינן ניתנות להערכת הפעילות של מספר רב של גרסאות. בעבודה קודמת, UBE3A זוהה כמפעיל את מסלול ה-Wnt בתאי HEK293T על ידי ויסות תפקוד הפרוטאזום כדי להאט את הפירוק של β-קטנין17. תובנה זו מאפשרת את השימוש בכתבי מסלול Wnt כשיטה יעילה ומהירה לזיהוי גרסאות אובדן ורווח של פונקציה של Ube3a18. הפרוטוקול שלהלן מתאר בפירוט שיטה ליצירת וריאנטים של Ube3a וכן כתב מבוסס לוציפראז להערכת שינויים בפעילות של וריאנטים של Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה ומדרגית להערכת הפעילות האנזימטית של גרסאות Ube3a. ישנם מספר פרטים טכניים המחייבים שיקול דעת זהיר בעת שימוש בבדיקה זו. שיקול אחד הוא הבחירה בפלסמידים של כתב Wnt המשמשים בבדיקה זו. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באופן ספציפי ב-β-catenin מופעל reporter (BAR)2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס גשר לעצמאות של קרן סימונס (פרס SFARI #387972; J.J.Y.), פרס חוקר צעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (J.J.Y.), מלגת מחקר מקרן אלפרד פ. סלואן (J.J.Y.), ומענקי מחקר מקרן תסמונת אנג’למן (J.J.Y.), קרן וייטהול (J.J.Y.) ו- NIMH (R01MH122786; ג’יי.ג’יי.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
