Eine skalierbare, zellbasierte Methode zur funktionellen Bewertung von Ube3a-Varianten

Jüngste technologische Fortschritte haben die Sequenzierung von Exomen und Genomen in klinischen Umgebungen zur Routine gemacht ^1,2. Dies hat zur Entdeckung einer großen Anzahl genetischer Varianten geführt, darunter Millionen von Missense-Varianten, die typischerweise eine Aminosäure in einem Protein verändern. Das Verständnis der funktionellen Bedeutung dieser Varianten bleibt eine Herausforderung, und nur ein kleiner Bruchteil (~2%) der bekannten Missense-Varianten hat eine klinische Interpretation ^1,3.

Ein prominentes Beispiel für dieses Problem ist Ube3a, ein Gen, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die auf Substratproteine für den Abbau^{abzielt 4}. Ube3a befindet sich auf Chromosom 15q11-13 und wird ausschließlich aus dem mütterlich vererbten Allel ^5,6,7 exprimiert. Beobachtungen aus der Krankheitsgenetik deuten stark darauf hin, dass eine unzureichende oder übermäßige Aktivität des UBE3A-Enzyms unterschiedliche neurologische Entwicklungsstörungen verursacht. Die Deletion des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 verursacht das Angelman-Syndrom (AS)8, eine Störung, die durch schwere geistige Behinderung, motorische Beeinträchtigungen, Krampfanfälle, ein fröhliches Auftreten mit häufigem Lächeln und dysmorphe Gesichtszüge gekennzeichnet^ist 8,9,10. Im Gegensatz dazu verursacht die Duplikation oder Verdreifachung des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 das Dup15q-Syndrom, eine heterogene Erkrankung, die als eine der häufigsten syndromalen Formen von Autismus anerkannt^{wird 11,12,13}. Darüber hinaus gibt es Hunderte von Missense-Varianten, die in Ube3a identifiziert wurden, von denen die meisten als Varianten von ungewisser Signifikanz (VUS) gelten, da ihre funktionelle und klinische Bedeutung unbekannt ist. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die Ube3a-Varianten empirisch bewerten können, um festzustellen, ob sie zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen.

Das UBE3A-Enzym gehört zur HECT-Domänenfamilie (homolog to E6-AP C-terminus) von E3-Ubiquitin-Ligasen, die alle die gleichnamige HECT-Domäne besitzen, die die biochemische Maschinerie enthält, die notwendig ist, um aktiviertes Ubiquitin von E2-Enzymen aufzunehmen und auf Substratproteine zu übertragen¹⁴. In der Vergangenheit stützte sich die Charakterisierung von E3-Enzymen auf rekonstituierte In-vitro-Systeme, die ein Ensemble gereinigter Proteine^erfordern 4,15,16. Solche Methoden sind langsam und arbeitsintensiv und können die Aktivität einer großen Anzahl von Varianten nicht beurteilen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass UBE3A den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen aktiviert, indem es die Funktion des Proteasoms moduliert, um den Abbau von β-Catenin¹⁷ zu verlangsamen. Diese Erkenntnis ermöglicht den Einsatz von Wnt-Signalwegreportern als effiziente und schnelle Methode, um sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Varianten von Ube3a¹⁸ zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert eine Methode zur Erzeugung von Ube3a-Varianten sowie einen Luciferase-basierten Reporter zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivität von Ube3a-Varianten.