Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a
Summary
Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.
Abstract
L’utilisation accrue du séquençage en médecine a permis d’identifier des millions de variantes codantes dans le génome humain. Beaucoup de ces variantes se produisent dans les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux, mais la signification fonctionnelle de la grande majorité des variantes reste inconnue. Le présent protocole décrit l’étude des variantes de Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 liée à la fois à l’autisme et au syndrome d’Angelman. La duplication ou la triplication d’Ube3a est fortement liée à l’autisme, alors que sa délétion provoque le syndrome d’Angelman. Ainsi, la compréhension de la valence des changements dans l’activité de la protéine UBE3A est importante pour les résultats cliniques. Ici, une méthode rapide basée sur les cellules qui associe les variantes Ube3a avec un rapporteur de voie Wnt est décrite. Ce test simple est évolutif et peut être utilisé pour déterminer la valence et l’ampleur des changements d’activité dans n’importe quelle variante d’Ube3a . De plus, la facilité de cette méthode permet la génération d’une mine d’informations structure-fonction, qui peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les mécanismes enzymatiques d’UBE3A.
Introduction
Les progrès technologiques récents ont rendu le séquençage des exomes et des génomes systématique en milieu clinique 1,2. Cela a conduit à la découverte d’un grand nombre de variantes génétiques, y compris des millions de variantes faux-sens qui modifient généralement un acide aminé dans une protéine. Comprendre la signification fonctionnelle de ces variantes reste un défi, et seule une petite fraction (~2%) des variantes faux-sens connues ont une interprétation clinique 1,3.
Un exemple frappant de ce problème est Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 qui cible les protéines substrat pour la dégradation4. Ube3a réside dans le chromosome 15q11-13 et est exprimé exclusivement à partir de l’allèle maternel 5,6,7. Les observations de la génétique de la maladie suggèrent fortement qu’une activité insuffisante ou excessive de l’enzyme UBE3A provoque des troubles neurodéveloppementaux distincts. La délétion du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome d’Angelman (SA)8, un trouble caractérisé par une déficience intellectuelle sévère, des déficiences motrices, des convulsions, un comportement heureux avec des sourires fréquents et des traits du visage dysmorphiques 8,9,10. En revanche, la duplication ou la triplication du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome Dup15q, une maladie hétérogène reconnue comme l’une des formes syndromiques les plus répandues de l’autisme11,12,13. En outre, il existe des centaines de variantes faux-sens identifiées dans Ube3a, dont la majorité sont considérées comme des variantes de signification incertaine (VUS) car leur signification fonctionnelle et clinique est inconnue. Ainsi, il existe un intérêt considérable pour le développement de méthodes permettant d’évaluer empiriquement les variantes d’Ube3a afin de déterminer si elles contribuent à la maladie neurodéveloppementale.
L’enzyme UBE3A appartient à la famille de domaines HECT (homologue à E6-AP C-terminus) des ligases d’ubiquitine E3 qui possèdent toutes le domaine HECT éponyme, qui contient la machinerie biochimique nécessaire pour accepter l’ubiquitine activée des enzymes E2 et la transférer aux protéines substrat14. Historiquement, la caractérisation des enzymes E3 s’est appuyée sur des systèmes in vitro reconstitués qui nécessitent un ensemble de protéines purifiées 4,15,16. Ces méthodes sont lentes et laborieuses et ne se prêtent pas à l’évaluation de l’activité d’un grand nombre de variantes. Dans des travaux antérieurs, UBE3A a été identifié pour activer la voie Wnt dans les cellules HEK293T en modulant la fonction du protéasome pour ralentir la dégradation de la β-caténine17. Cet aperçu permet l’utilisation des rapporteurs de trajectoire Wnt comme méthode efficace et rapide pour identifier les variantes de perte et de gain de fonction d’Ube3a18. Le protocole ci-dessous décrit en détail une méthode pour générer des variantes Ube3a ainsi qu’un rapporteur basé sur la luciférase pour évaluer les changements dans l’activité des variants Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace et évolutive pour évaluer l’activité enzymatique des variantes d’Ube3a. Plusieurs détails techniques méritent d’être soigneusement examinés lors de l’utilisation de ce test. Une considération est le choix des plasmides rapporteurs Wnt utilisés dans ce test. Le protocole décrit ici utilise spécifiquement le rapporteur activé par la β-caténine (BAR)21, un rapporteur qui contient un concatémère de 12 éléments de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un prix Bridge to Independence de la Fondation Simons (SFARI Award #387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), une bourse de recherche de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) et des subventions de recherche de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de la Whitehall Foundation (J.J.Y.) et du NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
