طريقة قابلة للتطوير قائمة على الخلايا للتقييم الوظيفي لمتغيرات Ube3a
Summary
تم تطوير طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لتقييم الأهمية الوظيفية للمتغيرات الخاطئة في Ube3a ، وهو جين يرتبط فقدانه واكتسابه لوظيفته بكل من متلازمة أنجلمان واضطراب طيف التوحد.
Abstract
أدى الاستخدام المتزايد للتسلسل في الطب إلى تحديد ملايين المتغيرات المشفرة في الجينوم البشري. تحدث العديد من هذه المتغيرات في الجينات المرتبطة باضطرابات النمو العصبي ، لكن الأهمية الوظيفية للغالبية العظمى من المتغيرات لا تزال غير معروفة. يصف البروتوكول الحالي دراسة المتغيرات ل Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase المرتبط بكل من التوحد ومتلازمة Angelman. يرتبط تكرار أو ثلاثة أضعاف Ube3a ارتباطا وثيقا بالتوحد ، في حين أن حذفه يسبب متلازمة أنجلمان. وبالتالي ، فإن فهم تكافؤ التغيرات في نشاط بروتين UBE3A مهم للنتائج السريرية. هنا ، يتم وصف طريقة سريعة قائمة على الخلايا تقرن متغيرات Ube3a مع مراسل مسار Wnt. هذا الفحص البسيط قابل للتطوير ويمكن استخدامه لتحديد التكافؤ وحجم تغيرات النشاط في أي متغير Ube3a . علاوة على ذلك ، فإن تسهيل هذه الطريقة يسمح بتوليد ثروة من معلومات وظيفة الهيكل ، والتي يمكن استخدامها لاكتساب رؤى عميقة في الآليات الأنزيمية ل UBE3A.
Introduction
جعلت التطورات التكنولوجية الحديثة تسلسل الإكسومات والجينوم روتينيا في البيئات السريرية 1,2. وقد أدى ذلك إلى اكتشاف عدد كبير من المتغيرات الجينية ، بما في ذلك الملايين من المتغيرات الخاطئة التي عادة ما تغير حمضا أمينيا واحدا في البروتين. لا يزال فهم الأهمية الوظيفية لهذه المتغيرات يمثل تحديا ، ولا يوجد سوى جزء صغير (~ 2٪) من المتغيرات الخاطئة المعروفة لها تفسير سريري 1,3.
ومن الأمثلة البارزة على هذه المشكلة Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase الذي يستهدف بروتينات الركيزة للتحلل4. يوجد Ube3a داخل الكروموسوم 15q11-13 ويتم التعبير عنه حصريا من الأليلالموروث من الأم 5،6،7. تشير الملاحظات من علم الوراثة المرضية بقوة إلى أن النشاط غير الكافي أو المفرط لإنزيم UBE3A يسبب اضطرابات نمو عصبي متميزة. يؤدي حذف كروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة أنجلمان (AS) 8 ، وهو اضطراب يتميز بإعاقة ذهنية شديدة ، وإعاقات حركية ، ونوبات ، وسلوك سعيد مع ابتسامة متكررة ، وملامح وجه مشوهة8،9،10. في المقابل ، يؤدي الازدواجية أو المضاعفة الثلاثية لكروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة Dup15q ، وهي حالة غير متجانسة معترف بها كواحدة من أكثر أشكال التوحد انتشارا11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، هناك المئات من المتغيرات الخاطئة التي تم تحديدها في Ube3a ، والتي يعتبر معظمها متغيرات ذات أهمية غير مؤكدة (VUS) لأن أهميتها الوظيفية والسريرية غير معروفة. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بتطوير طرق يمكنها تقييم متغيرات Ube3a تجريبيا لتحديد ما إذا كانت تساهم في مرض النمو العصبي.
ينتمي إنزيم UBE3A إلى عائلة مجال HECT (المتماثلة مع E6-AP C-terminus) من أربطة E3 ubiquitin التي تمتلك جميعها مجال HECT المسمى ، والذي يحتوي على الآلات الكيميائية الحيوية اللازمة لقبول ubiquitin المنشط من إنزيمات E2 ونقله إلى بروتينات الركيزة14. تاريخيا ، اعتمد توصيف إنزيمات E3 على الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تتطلب مجموعة من البروتينات المنقاة4،15،16. هذه الأساليب بطيئة وكثيفة العمالة وغير قابلة لتقييم نشاط عدد كبير من المتغيرات. في العمل السابق ، تم تحديد UBE3A لتنشيط مسار Wnt في خلايا HEK293T عن طريق تعديل وظيفة البروتيازوم لإبطاء تدهور β-catenin17. تسمح هذه الرؤية باستخدام مراسلي مسار Wnt كطريقة فعالة وسريعة لتحديد كل من متغيرات الخسارة والكسب الوظيفي ل Ube3a18. يصف البروتوكول أدناه بالتفصيل طريقة لإنشاء متغيرات Ube3a بالإضافة إلى مراسل قائم على luciferase لتقييم التغييرات في نشاط متغيرات Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة وقابلة للتطوير لتقييم النشاط الأنزيمي لمتغيرات Ube3a. هناك العديد من التفاصيل الفنية التي تتطلب دراسة متأنية عند استخدام هذا الفحص. أحد الاعتبارات هو اختيار بلازميدات مراسل Wnt المستخدمة في هذا الفحص. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا على وجه التحدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة سيمونز جسر إلى الاستقلال (جائزة SFARI #387972; J.J.Y.) ، وجائزة NARSAD للباحثين الشباب من مؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (JJY) ، وزمالة بحثية من مؤسسة Alfred P. Sloan (JJY) ، ومنح بحثية من مؤسسة Angelman Syndrome Foundation (JJY) ، ومؤسسة Whitehall (J.J.Y.) ، و NIMH (R01MH122786; ج. ج. ي.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
