ラットの運動努力を最大化し、生理学的変化を誘発するための慢性高強度インターバルトレーニングと食事誘発性肥満モデル

本研究で説明されているすべての手順は、実験動物のケアと使用に関するガイド、第8版に従っています。実験デザインは、ウェストバージニアオステオパシー医学部のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)2019-5の下で、Office of Research and Sponsored Programs(ORSP)によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 と 表1 を参照してください。プロトコルのタイムラインの一般的な概要を 図1に示します。 1. 実験計画 市販の雌、21日齢のSprague-Dawleyラットを40匹使用しました( 資料表を参照)。 IACUCガイドラインに従って動物を取り扱うときは、適切な保護具を使用してください。これらの安全対策には、使い捨ての滅菌手袋、白衣、靴カバーなどの着用が含まれますが、これらに限定されません。 各動物の体重を量り、平均と平均の標準誤差を計算して、グループの体重に差がないことを確認します。グループが異なる場合は、体重の重い個人を軽いグループに、体重の軽い個人を重いグループに再配分して、体重のグループを一致させます。 動物を無作為に4つのグループに分けます:対照(CON、n = 10)、対照食/運動訓練(TRN、n = 10)、高脂肪食/対照(HFD、n = 10)、および高脂肪食/運動訓練(HFD / TRN、n = 10)。 制御された環境(12時間の明暗サイクル、21°C±2°C、湿度60%±10%)でラットを個々のケージ(ケージごとに1匹)に収容し、すべてのラットを市販の実験室用チャウ( 材料表を参照)の対照食に1週間順応させます。各ケージに濃縮装置(シェルター、かじり物、巣材)を提供します。注:CONダイエットは、市販の実験室用チャウ( 詳細については、材料 表と 表1 を参照)と脂肪から10%kcal(3.82 kcal / g)で構成されています。 実験全体を通して、食物と水への 自由アクセス を許可します。 1週間の順応期間の後、HFDおよびHFD / TRNグループにHFDチャウを供給することにより、8週間の食事療法期間を開始します。HFDチャウ(詳細については、 材料 表および 表1 を参照)は、脂肪からの45%kcal(4.7 kcal / g)で構成されており、典型的な西洋の食事に見られる主要栄養素の分解を表しています。すべての動物が食物と水を 自由自 在に入手し続けられるようにする。各週の初めに、各動物に与えられたチャウの質量を量り、記録します。140gのチャウを使用して、各動物に1週間餌を与えます。 チャウの重量を量るには、計量ボートを精密電子デジタルスケール( 材料表を参照)に置き、「風袋引き」ボタンを押してスケールを風袋引きします。計量ボートに140gのチャウを入れ、はかりの重量(g)を記録します。これは「前」の重みです。 チャウを個々の動物の飼育ケージの飼料トラフに入れます。 動物がチャウの量が少なくなり始めたら、追加の割り当て量(残りの日ごとに20 g)を量り、そのチャウをフードトレイに追加します。各動物にどれだけのチャウを追加で与えるかを記録します。動物がペレットを消費するのに苦労している場合に、より簡単に消費できるように、ホッパー内の餌の上に重量を追加する必要がある場合があります(ホッパー内の丸みを帯びたペレットで証明されるように)。 各週の終わりに、各動物の残りのチャウの重さを量ります。すべての動物は、 アドリビタムを食べることができるように、チャウを余分に持っている必要があります。同じスケールを使用して、残りの食品を記録します。これが「後」の重みです。 個々の動物の「前体重」から「後」の体重を差し引いて、1週間あたりの食物摂取量(g)を記録します。 8週間の食事導入期間の後、TRNおよびHFD / TRNのラットのHIITトレーニングプロトコルを開始します。これは、毎週月曜日、火曜日、木曜日、金曜日の午前8時から午前10時までのトレーニングセッション(以下の「HIITトレーニングプロトコル」を参照)を含む8週間のHIITレジメンで構成されています。注:このプロトコルは各コホートのパフォーマンスを最大化するように設計されており、各コホートは異なる可能性があるため、グループ間のプロトコルの標準化はありません(食事によって誘発される表現型のため)。 吸入イソフルラン(5%)を使用した麻酔導入後の重要な組織採取 により 、最後の運動セッションの48時間後にラットを安楽死させます。.まず、麻酔を誘発するのに十分な酸素とイソフルランがシステムにあることを確認します。メインバルブ(通常はタンクの上部)を反時計回りに回して、酸素タンクを開きます。酸素タンクのサイズによっては、酸素タンクにも開く必要があるレギュレーターバルブがある場合とない場合があります。さらに、排気チューブが適切に固定されていること、および収集キャニスターが重量を超えていないことを確認してください。 使用前にキャニスターの重量を量り、キャニスターの側面にある日付と重量をメモします。活栓が誘導室に対して開いており、ノーズコーンへの活栓が閉じていることを確認してください。 麻酔を誘発するには、動物を誘導室に入れ、ロック装置を固定して室を密閉します。安全ロックを押し下げ、ダイヤルを反時計回りに回して、イソフルランを5%に設定します。 次に、酸素流量計の底部にあるダイヤルを、メーターが1.5〜2 L / minになるまで反時計回りに回します。 1〜2分後、動物が意識を失ったら、安全ロックを押しながらダイヤルを時計回りに回してイソフルランをオフにします。酸素放出バルブを3〜5秒間押して、誘導チャンバーを酸素で洗い流します。誘導チャンバーのロックを解除し、意識不明の動物を取り除きます。 意識を失った動物を仰向けに寝かせ、ノーズコーンを固定してさらに麻酔をかけます。フェイスマスクの配送には活栓を開き、誘導チャンバーには活栓を閉じます。ペダル反射がなくなるまで、フェイスマスク を介して 麻酔用の5%イソフルランと100%酸素を投与します。.麻酔をかけられた動物のつま先をつまむ力を加え、反射反応を探すことで、ペダル反射を確認します。 IACUCが承認した方法(研究によって異なる場合があります)に従って動物を犠牲にし、測定とさらなる分析のために標的組織(皮下脂肪組織、腎周囲脂肪組織、骨格筋、肝臓、生殖腺、および心臓)を慎重に解剖します。IACUCのプロトコルに応じて、安楽死はギロチンによる斬首または重要な組織(心臓)の採取によって完了することができます。心臓を集めるには、肋骨の下と横隔膜を切開します。心臓の位置を特定し、血管系(大動脈、大静脈、肺動脈、肺静脈)を手術用ハサミで切断します。鉗子で心臓をつかみ、結合組織を切断して心臓を解放します。素早く作業し、生理食塩水で心臓をすすぎ、ガーゼで余分な水分を軽くたたき、体重を記録します。必要に応じて、左心室、右心室、中隔を手術用ハサミで分離し、個別に重量を量ります。 心臓組織サンプルをクライオバイアルに入れ、液体窒素で急速凍結します。 次に、メスで腹部を縦方向に切開し、臍帯から動物の外側に2つの横切開を行い、腹部の臓器にアクセスできるようにします。鉗子と手術用ハサミを使用して、目的の臓器をすべて取り除きます。注:この研究では、肝臓、内臓(腹部)脂肪組織、膵臓、および腓腹筋が収集されました。腹部脂肪組織は、臓器および体腔壁の周りの結合組織を穏やかにトリミングすることにより、1つまたは2つの大きなセクションに分けて除去されました。皮下脂肪は、以前の方法22と同様に収集されませんでした。 臓器については、摘出後、風袋引きスケールの清潔な計量ボートに入れます。重量(g)を記録し、サンプルをクライオバイアルに入れて急速凍結します。 腓腹筋の場合は、下腿の外側に2回、アキレス腱を横切って水平に1回切開します。皮膚と筋肉組織をつなぐ結合組織を切断または引き裂いて、腓腹筋を露出させます。アキレス腱を手術用ハサミでできるだけ筋肉の近くで切り、鉗子で腓腹筋をつかみます。 腓腹筋を上部の接続点までたどり、同様の切り込みを入れて筋肉を解放します。 清潔で風袋入りの計量ボートでサンプルを秤量し、クライオバイアルに入れ、液体窒素で瞬間凍結します。 採取した他の組織サンプルは直ちにクライオバイアルに入れ、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 これらの組織は、研究目標に応じて、PCR、ウェスタンブロット、またはその他の方法などの将来の実験室分析のために保存することができます。 2. HIITトレーニングプロトコル トレーニングセッションを開始するには、コントロールユニットの背面にある電源スイッチを切り替えて、トレッドミル( 材料表を参照)をオンにします。 モニターが0.00mAを示すまでコントロールユニットのダイヤルを反時計回りに回して、トレッドミルショックを0.00mAに調整します。 トレッドミルの底にあるロックナットを緩め、傾斜を最初のノッチに設定して、トレッドミルの傾斜を5.0%に設定します。ロックナットを締め直して、トレッドミルの傾斜をこの位置に固定します。 片手で動物の体を支え、もう片方の手で尻尾の付け根をそっとつかみ、トレッドミルの個々のレーンに動物を置きます。 トレッドミルの 5 つのレーンすべてが同じコホートのラットによって占有されるまで、このプロセスを繰り返します。 モニターが45cm / sになるまでスピードダイヤルを時計回りに回して、トレッドミルの速度を45cm / sに調整します。 停止/ 実行ボタンを押してトレッドミルを開始し、5分間実行します。停止 /実行 ボタンをもう一度押すと、5分後にトレッドミルが停止します。この間、感電は使用されません。注:動物は、トレッドミルの使用方法の学習を容易にするために、プロトコルの初期段階でショックグリッドから離れるために、硬い毛のブラシで励ましが必要な場合があります。 5分間が終わったら、2分間休憩してからトレーニングを開始します。モニターがトレーニングの試合の開始速度を読み取るまで、コントロールユニットのダイヤルを時計回りに回します。最初のセッションでは、55 cm/sの初期走行速度を使用します。新しいトレーニング日の最初のスプリントでは、前日に達成した最高速度よりも4cm/秒遅い開始速度を使用します。スタートボタンを押してトレッドミルを始動し、モニターが1:00(1分)を示すまで動物を走らせてから、もう一度停止/実行ボタンを押してトレッドミルを停止します。 ブラシで動物をかき混ぜて、動物がショックグリッド(トレッドミルの後部にある)に到達した場合に前進を促します。トレーニンググループごとに、トレーニングの1試合に2回以上ブラシに反応しない動物がいる場合は、残りのセッションでショックグリッドを2.0mAにオンにします。 スプリントの後、動物を2分間休ませます。2分間の休憩が終わったら、コントロールユニットの ストップ/ラン ボタンを押してトレッドミルを開始し、次のスプリントを開始します。トレッドミルの速度に関する詳細は以下のとおりです。コホート内の5匹の動物すべてが、1分間のスプリントインターバルでモチベーション(硬い毛ブラシで励ましたり、ショックグリッドに5回以上触れたり)を必要とせずにスプリントインターバルを完了した場合、次のスプリント間隔で速度を前回使用した速度から4cm/s上げます。コントロールユニットのスピードノブを時計回りに回すと、スピードが上がります。 ブラシを使用してランニングを促す場合、または動物が1分間のスプリントで5回以上ショックグリッドに触れる場合は、前のスプリントインターバルと同じインターバル速度を使用します。 スプリントインターバル中に動物が過度にもがいた場合(ショックグリッドの累積時間が20秒以上)は、次のインターバルの速度を4cm/s下げます。注:私たちの経験では、100%の動物が必要なランニングを完了することができました。それにもかかわらず、動物は、走ることを望まない、または過度のショックを経験した場合、研究者の裁量で研究から除外する必要がある場合があります。 各試合のスピードと距離を記録します。 このプロセスを繰り返して、トレーニング日ごとに合計10回のHIITトレーニングを行います。各トレーニングの試合は、1分間の高強度ランニングと2分間の休憩で構成されています。 トレーニングセッションの最後に、各動物をトレッドミルから取り出し、個別のケージに入れます。 新しいトレーニング日ごとに、最初の試合の最初のランニング速度は、前日のトレーニングで得られた最高速度よりも4cm/秒遅く、最低速度は55cm/sです。 3. 統計解析 形態測定値とその他の結果指標を平均誤差と標準誤差として報告します。 多重比較を可能にする混合効果モデルを使用して、分析ソフトウェア( 材料表を参照)でグループ間の差異を決定します。注:Šidák補正は、多重比較を考慮して実装されました。必要に応じて、反復測定モデルが実装されました。有意差は p <0.05で決定した。