Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

La coclea è l’organo sensoriale periferico per l’udito nei mammiferi. Ha una complessa anatomia a spirale di cellule sensoriali e di supporto ripetute che sono anatomicamente specializzate per rilevare le vibrazioni sonore e trasmetterle al cervello per la percezione dell’udito. I principali elementi sensoriali sono le cellule ciliate interne ed esterne e le loro fibre nervose innervanti i cui corpi cellulari compongono il ganglio a spirale, che risiede all’interno del canale di Rosenthal (Figura 1). Queste strutture sensoriali e neurali sono disposte tonotopicamente in modo tale che i suoni ad alta frequenza siano trasdotti nella base cocleare e i suoni a bassa frequenza siano trasdotti nell’apice² della coclea. Una mappa anatomica di questa distribuzione cellulare sensoriale lungo la lunghezza della spirale della membrana basilare di supporto è chiamata citococleogramma³ e può essere confrontata con la perdita dell’udito in funzione della frequenza come raffigurato in un audiogramma.

Il labirinto membranoso della coclea, che è circondato da ossa dense, rende tecnicamente difficile esaminare più di una struttura cocleare alla volta. Pertanto, la logica per lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce è quella di produrre sezioni seriali ben allineate della coclea completa in modo che tutte le strutture cocleari possano essere esaminate l’una rispetto all’altra nelle ricostruzioni 3D. Voie et ^al.4 e Voie e Spelman⁵ progettarono il primo microscopio a foglio di luce, chiamato microscopio OPFOS (orthogonal plane fluorescence optical sectioning), per sezionare otticamente l’intera coclea. Tuttavia, questo microscopio non è mai stato sviluppato commercialmente; quindi, il nostro obiettivo era quello di costruire un microscopio a foglio leggero chiamato microscopio laser a foglio sottile (TSLIM; Figura 2). I dettagli di progettazione e costruzione di TSLIM sono stati precedentemente pubblicati⁸. TSLIM ha apportato diversi miglioramenti rispetto all’OPFOS, tra cui l’utilizzo di una fotocamera digitale a bassa illuminazione rispetto a una telecamera CCD per la raccolta di immagini, microposizionatori codificati otticamente per un movimento accurato e riproducibile del campione attraverso il foglio luminoso, l’uso di una camera del campione otticamente trasparente disponibile in commercio e la colorazione della rodamina in etanolo piuttosto che nella soluzione di compensazione per prevenire la precipitazione delle macchie all’interno del tessuto. Lo sviluppo commerciale di microscopi a foglio di luce come SPIM⁶ si è concentrato sull’imaging ad alta risoluzione di piccoli campioni trasparenti vivi, ma non sono adatti per l’imaging cocleare intero in quanto mancano di un’adeguata distanza di lavoro. Una rassegna dello sviluppo di altri microscopi a foglio di luce è stata pubblicata da Santi⁷. Il vantaggio principale di TSLIM rispetto ad altri metodi istologici per esaminare la coclea è quello di sezionare otticamente i tessuti per la ricostruzione 3D preservando l’integrità del campione in modo che possa essere utilizzato da altri metodi istologici. Un altro vantaggio dell’imaging TSLIM è che solo un sottile foglio di luce prodotto da un laser viene esposto al tessuto, rispetto all’esposizione all’intero spessore del tessuto al laser come nella microscopia confocale. La pulizia del tessuto per ridurre al minimo la dispersione della luce e il fatto che solo una piccola parte del tessuto sia esposta al laser si traduce in uno sbiadimento minimo del fluorocromo (fotosbiancamento) con l’imaging laser a foglio di luce. Tuttavia, il processo di fissazione, disidratazione e compensazione altera la morfologia delle strutture cocleari e provoca il restringimento dei tessuti rispetto al tessuto vivente. La quantità effettiva di restringimento tissutale che si verifica non è stata determinata.

TSLIM è stato sviluppato da Shane Johnson e otto studenti tedeschi di ingegneria ottica (vedi Riconoscimenti). I dettagli costruttivi di TSLIM sono stati forniti da Santi et ^al.8 e una versione di scansione (sTSLIM) da Schröter et ^al.9. TSLIM funziona come microtomo non distruttivo per i campioni a sezione ottica e come microscopio per raccogliere sezioni seriali 2D attraverso l’intera larghezza e spessore della coclea. TSLIM può visualizzare campioni piccoli (mm) e grandi (cm) di spessore. Le lenti sono montate ad aria per consentire lunghe distanze di lavoro con obiettivi di raccolta di 1x e 2x su un microscopio a dissezione. Il microscopio a dissezione ha anche un’ottica zoom che consente a TSLIM di risolvere le strutture subcellulari e sinaptiche sulle cellule. TSLIM è dotato di un laser blu (473 nm) e verde (532 nm) per l’illuminazione che consente di utilizzare una varietà di sonde fluorescenti per l’imaging. L’obiettivo di TSLIM è quello di produrre sezioni ottiche 2D ben allineate attraverso un’intera coclea per una ricostruzione digitale completa dei tessuti cocleari. Poiché si tratta di un metodo fluorescente, i ligandi e l’immunoistochimica possono anche essere utilizzati per identificare specifiche strutture cocleari.

Inizialmente, una lente cilindrica è stata utilizzata per produrre due fogli di luce gaussiani opposti, ma ha prodotto artefatti di imaging di assorbimento. A causa del lavoro di Keller et ^al.10, la lente cilindrica fissa è stata sostituita da uno specchio galvanometrico a scansione per produrre il foglio luminoso⁹. Inoltre, poiché il centro del foglio luminoso è il più sottile alla vita del fascio, le immagini 2D di sTSLIM vengono prodotte raccogliendo un composito di colonne di dati sull’asse X attraverso la larghezza del campione (Figura 3). Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Buytaert e Dircks¹¹. Il software personalizzato TSLIM per guidare e raccogliere immagini è stato sviluppato utilizzando un programma grafico per il controllo dello strumento. Il foglio luminoso viaggia attraverso il campione e illumina un piano fluorescente all’interno del tessuto. Questo piano fluorescente viene proiettato ortogonalmente attraverso il campione trasparente e viene raccolto da un microscopio a dissezione. I microposizionatori codificati otticamente consentono di scansionare attraverso la vita del fascio nell’asse X per raccogliere una singola immagine 2D composita e, successivamente, il microposizionatore dell’asse Z sposta il campione su un piano più profondo all’interno del tessuto per ottenere una pila di immagini 2D sezionate seriali (Video 1, Figura 4). Una pila di immagini traslazionali viene raccolta attraverso l’intera larghezza, spessore e lunghezza della coclea e non è richiesta la cucitura delle immagini (Video 2). Lo stack di immagini viene trasferito su un altro computer e caricato in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D. Le pile di immagini contengono tutte le informazioni digitali sulla morfologia di una coclea alla risoluzione del microscopio. Tuttavia, se è richiesta una risoluzione più elevata, la coclea intatta può essere ulteriormente elaborata con metodi istologici distruttivi come il sezionamento del microtomo, la scansione e la microscopia elettronica a trasmissione.

Il programma di rendering 3D viene utilizzato per segmentare diverse strutture cocleari per il rendering 3D e l’analisi quantitativa. Per la segmentazione, ogni struttura in ogni immagine 2D della pila viene tracciata utilizzando un colore diverso da una tavoletta grafica e una penna (Figura 5). Ad oggi, sono state segmentate 20 diverse strutture cocleari (Figura 6). Dopo la segmentazione, è possibile eseguire una varietà di analisi 3D. Ad esempio, il software di rendering 3D può virtualmente resezionare la coclea in qualsiasi piano lungo il centroide della struttura. Il video 3 mostra il sezionamento tangenziale all’organo di Corti, che rivela le cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare. Questo processo richiede innanzitutto la segmentazione manuale della struttura di interesse. Successivamente, il centroide della struttura viene calcolato in base all’adattamento dei minimi quadrati dei punti spline posizionati lungo il centro della struttura dalla sua base al suo apice, consentendo così un’approssimazione della lunghezza della struttura (Video 4). Un processo simile chiamato scheletratura può essere utilizzato per visualizzare la larghezza radiale della struttura lungo la sua lunghezza utilizzando una mappa a colori (Video 4). Il volume totale di ogni struttura viene calcolato dal programma dopo la segmentazione, ma le distanze relative possono anche essere quantificate e visualizzate con mappe a colori in un software di rendering 3D (Figura 7). Le strutture segmentate possono anche essere esportate per produrre rendering di modelli in plastica solida ingranditi (Figura 8). Inoltre, il conteggio semi-automatico delle celle può essere eseguito anche utilizzando il software di rendering 3D (Figura 9). L’immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per colorare specifiche strutture cocleari e queste strutture possono essere isolate da altre strutture cocleari per la valutazione morfometrica come la produzione di un citococleogramma (Figura 10). Lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero di tutte le strutture cocleari possono essere determinati dai modelli 3D, rendendo questo approccio ideale per mappare i danni cocleari alle menomazioni funzionali. In particolare, i danni cocleari dovuti all’invecchiamento, traumi indotti dal rumore o altri insulti possono essere mostrati e quantificati in ricostruzioni cocleari 3D da sezioni ottiche 2D. Una volta che una coclea è stata digitalizzata ci sono numerosi algoritmi di imaging che possono essere utilizzati per valutare il danno cocleare di qualsiasi tessuto all’interno della coclea nel registro anatomico ad altri tessuti cocleari.