הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

השבלול הוא איבר החישה ההיקפי לשמיעה אצל יונקים. יש לו אנטומיה ספירלית מורכבת של תאים חושיים ותומכים חוזרים המתמחים אנטומית כדי לזהות תנודות קול ולהעבירם למוח לתפיסת השמיעה. מרכיבי החישה העיקריים הם תאי השערה הפנימיים והחיצוניים וסיבי העצב המעצבבים שלהם, שגופם התא מרכיב את הגנגליון הספירלי, השוכן בתוך התעלה של רוזנטל (איור 1). מבנים חושיים ועצביים אלה מסודרים באופן טונוטופי כך שצלילים בתדר גבוה מומרים בבסיס השבלול וצלילים בתדר נמוך מומרים בקודקוד^{השבלול 2}. מפה אנטומית של התפלגות תאים חושיים זו לאורך הספירלי של הממברנה הבזילארית התומכת נקראת ציטוקוכלאוגרמה³ וניתן להשוות אותה עם ליקוי שמיעה כפונקציה של תדר כפי שמתואר באודיוגרמה.

המבוך הקרומי של השבלול, המוקף בעצם צפופה, מקשה מבחינה טכנית לבחון יותר ממבנה שבלול אחד בכל פעם. לכן, הרציונל לפיתוח מיקרוסקופ יריעות אור הוא לייצר מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול השלם, כך שניתן יהיה לבחון את כל מבני השבלול ביחס זה לזה בשחזורים תלת-ממדיים. Voie et ^al.4 ו-Voie and Spelman⁵ תכננו את המיקרוסקופ הראשון של יריעות אור, שנקרא מיקרוסקופ חתך אופטי פלואורסצנטי מישורי אורתוגונלי (OPFOS), כדי לחתוך אופטית את כל השבלול. עם זאת, מיקרוסקופ זה מעולם לא פותח מסחרית; לכן, מטרתנו הייתה לבנות מיקרוסקופ גיליון אור שנקרא מיקרוסקופ הדמיה לייזר דק (TSLIM; איור 2). פרטי התכנון והבנייה של TSLIM פורסמו בעבר⁸. TSLIM ביצעה מספר שיפורים לעומת OPFOS, כולל שימוש במצלמה דיגיטלית בתאורה חלשה לעומת מצלמת CCD לאיסוף תמונות, מיקרופוזיציות מקודדות אופטית לתנועה מדויקת וניתנת לשחזור של הדגימה דרך יריעת האור, שימוש בתא דגימה זמין מסחרית ושקוף אופטית, וצביעת רודמין באתנול במקום בתמיסת הניקוי למניעת משקעים של כתמים בתוך הרקמה. הפיתוח המסחרי של מיקרוסקופים קלילים כגון SPIM⁶ התמקד בהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות חיות ושקופות קטנות, אך הם אינם מתאימים לדימות שבלול שלם מכיוון שאין להם מרחק עבודה מספיק. סקירה של התפתחות מיקרוסקופים אחרים של יריעות אור פורסמה על ידי Santi⁷. היתרון העיקרי של TSLIM על פני שיטות היסטולוגיות אחרות לבדיקת השבלול הוא חתך רקמות אופטיות לשחזור תלת ממדי תוך שמירה על שלמות הדגימה, כך שניתן יהיה להשתמש בה בשיטות היסטולוגיות אחרות. יתרון נוסף של הדמיית TSLIM הוא שרק יריעת אור דקה המיוצרת על ידי לייזר נחשפת לרקמה, לעומת חשיפה לעובי רקמה שלמה ללייזר כמו במיקרוסקופ קונפוקלי. ניקוי רקמות כדי למזער את פיזור האור והעובדה שרק חלק קטן מהרקמה חשוף ללייזר מביא לדעיכה מינימלית של פלואורוכרום (פוטו-הלבנה) באמצעות הדמיית לייזר של יריעות אור. עם זאת, תהליך הקיבוע, ההתייבשות והניקוי משנה את המורפולוגיה של מבני השבלול וגורם להתכווצות הרקמה בהשוואה לרקמה חיה. כמות התכווצות הרקמה המתרחשת בפועל לא נקבעה.

TSLIM פותחה על ידי שיין ג’ונסון ושמונה סטודנטים גרמנים להנדסה אופטית (ראו תודות). פרטי הבנייה של TSLIM סופקו על ידי Santi et ^al.8 וגרסת סריקה (sTSLIM) על ידי Schröter et ^al.9. TSLIM מתפקד כמיקרוטום לא הרסני לחיתוך אופטי של דגימות וכמיקרוסקופ לאיסוף מקטעים טוריים דו-ממדיים דרך מלוא רוחב ועובי השבלול. TSLIM יכול לצלם דגימות קטנות (מ”מ) וגדולות (ס”מ), עבות. העדשות מותקנות באוויר כדי לאפשר מרחקי עבודה ארוכים עם יעדי איסוף של 1x ו-2x במיקרוסקופ דיסקציה. למיקרוסקופ הדיסקציה יש גם אופטיקת זום המאפשרת ל-TSLIM לפתור מבנים תת-תאיים וסינפטיים בתאים. TSLIM מצויד בלייזר כחול (473 ננומטר) וירוק (532 ננומטר) להארה המאפשרת שימוש במגוון בדיקות פלורסנט להדמיה. המטרה של TSLIM היא לייצר מקטעים אופטיים דו-ממדיים מיושרים היטב דרך שבלול שלם לשחזור דיגיטלי מלא של רקמות השבלול. מכיוון שמדובר בשיטה פלואורסצנטית, ליגנדות ואימונוהיסטוכימיה יכולות לשמש גם לזיהוי מבני שבלול ספציפיים.

בתחילה, עדשה גלילית שימשה לייצור שתי יריעות אור גאוסיאניות מנוגדות, אך היא הפיקה ממצאי דימות בליעה. בשל עבודתם של קלר ואחרים ¹⁰, העדשה הגלילית הקבועה הוחלפה במראה גלוונומטר סורקת כדי לייצר את גיליון האור⁹. נוסף על כך, מאחר שמרכז היריעה הבהירה הוא הדק ביותר במותני הקרן, תמונות sTSLIM 2D מופקות על-ידי איסוף קומפוזיט של עמודות נתונים על ציר X לרוחב הדגימה (איור 3). שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Buytaert ו Dircks¹¹. תוכנת TSLIM מותאמת אישית לנהיגה ואיסוף תמונות פותחה באמצעות תוכנה גרפית לבקרת מכשירים. יריעת האור עוברת דרך הדגימה ומאירה מישור פלואורסצנטי בתוך הרקמה. מישור פלואורסצנטי זה מוקרן באופן אורתוגונלי דרך הדגימה השקופה ונאסף על ידי מיקרוסקופ דיסקציה. מיקרופוזיציות מקודדות אופטית מאפשרות סריקה דרך מותני הקרן בציר X כדי לאסוף תמונה דו-ממדית מורכבת אחת, ולאחר מכן, המיקרופוזיציה של ציר Z מעבירה את הדגימה למישור עמוק יותר בתוך הרקמה כדי לקבל ערימה של תמונות דו-ממדיות טוריות חתוכות (וידאו 1, איור 4). ערימה של תמונות תרגום נאספת לכל רוחב, עובי ואורך השבלול, ואין צורך בתפירת תמונות (סרטון 2). מחסנית התמונות מועברת למחשב אחר ונטענת לתוכנית עיבוד תלת ממדית לשחזור וכימות תלת מימדי. ערימות התמונות מכילות את כל המידע הדיגיטלי על המורפולוגיה של שבלול ברזולוציה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם נדרשת רזולוציה גבוהה יותר, השבלול השלם יכול להיות מעובד עוד יותר על ידי שיטות היסטולוגיות הרסניות כגון חתך מיקרוטום, סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.

תוכנית העיבוד התלת-ממדית משמשת לפלח מבני שבלול שונים עבור עיבוד תלת-ממדי וניתוח כמותי. לצורך סגמנטציה, כל מבנה בכל תמונה דו-ממדית של הערימה מתבצע באמצעות צבע שונה באמצעות לוח ועט גרפיים (איור 5). עד כה חולקו 20 מבני שבלול שונים (איור 6). לאחר הפילוח ניתן לבצע מגוון ניתוחים תלת ממדיים. לדוגמה, תוכנת עיבוד תלת-ממדית יכולה למעשה לכרות מחדש את השבלול בכל מישור לאורך הצנטרואיד של המבנה. סרטון 3 מראה חתך משיק לאיבר של קורטי, אשר חושף את תאי השערה לאורך הקרום הבזילרי. תהליך זה דורש תחילה פילוח ידני של מבנה העניין. לאחר מכן, הצנטרויד של המבנה מחושב על פי התאמת הריבועים הפחותים של נקודות הספליין הממוקמות לאורך מרכז המבנה מבסיסו ועד קודקודו, ובכך מאפשר קירוב של אורך המבנה (סרטון 4). תהליך דומה שנקרא שלד יכול לשמש כדי להמחיש את הרוחב הרדיאלי של המבנה לאורכו באמצעות מפת צבע (וידאו 4). הנפח הכולל של כל מבנה מחושב על-ידי התוכנית לאחר הסגמנטציה, אך ניתן גם לכמת מרחקים יחסיים ולהמחיש אותם באמצעות מפות צבע בתוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 7). ניתן גם לייצא מבנים מפולחים כדי לייצר הדמיות מודל מוגדלות מפלסטיק מוצק (איור 8). נוסף על כך, ספירת תאים חצי-אוטומטית יכולה להתבצע גם באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 9). אימונוהיסטוכימיה וקשירת ליגנדים יכולות לשמש להכתמת מבנים ספציפיים של השבלול, וניתן לבודד את המבנים האלה ממבני שבלול אחרים לצורך הערכה מורפומטרית, כגון הפקת ציטוקוכלאוגרמה (איור 10). ניתן לקבוע אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר של כל מבני השבלול מהמודלים התלת-ממדיים, מה שהופך גישה זו לאידיאלית למיפוי נזקי שבלול לליקויים תפקודיים. באופן ספציפי, ניתן להראות ולכמת נזק לשבלול כתוצאה מהזדקנות, טראומה כתוצאה מרעש או עלבונות אחרים בשחזורים תלת-ממדיים של שבלול ממקטעים אופטיים דו-ממדיים. לאחר דיגיטציה של שבלול שבלול, ישנם אלגוריתמי הדמיה רבים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך נזק לשבלול של כל רקמה בתוך השבלול ברישום האנטומי לרקמות שבלול אחרות.