Bildgebung der alternden Cochlea mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Die Cochlea ist das periphere Sinnesorgan für das Gehör bei Säugetieren. Es hat eine komplexe spiralförmige Anatomie aus sich wiederholenden Sinnes- und Stützzellen, die anatomisch darauf spezialisiert sind, Schallschwingungen zu erkennen und sie zur Wahrnehmung des Gehörs an das Gehirn weiterzuleiten. Die wichtigsten sensorischen Elemente sind die inneren und äußeren Haarzellen und ihre innervierten Nervenfasern, deren Zellkörper das Spiralganglion bilden, das sich im Rosenthal-Kanal befindet (Abbildung 1). Diese sensorischen und neuronalen Strukturen sind tonotopisch so angeordnet, dass hochfrequente Töne in der Cochlea-Basis und niederfrequente Töne in der Cochlea-Spitze² transduziert werden. Eine anatomische Karte dieser sensorischen Zellverteilung entlang der Spirallänge der tragenden Basilarmembran wird als Zytocochleogramm³ bezeichnet und kann mit einem Hörverlust in Abhängigkeit von der Frequenz verglichen werden, wie in einem Audiogramm dargestellt.

Das membranöse Labyrinth der Cochlea, das von dichtem Knochen umgeben ist, macht es technisch schwierig, mehr als eine Cochlea-Struktur gleichzeitig zu untersuchen. Der Grundgedanke für die Entwicklung eines Lichtblattmikroskops besteht daher darin, gut ausgerichtete Serienschnitte der gesamten Cochlea herzustellen, so dass alle Cochlea-Strukturen in 3D-Rekonstruktionen relativ zueinander untersucht werden können. Voie et ^al.4 und Voie und Spelman⁵ entwarfen das erste Lichtblattmikroskop, das sogenannte OPFOS-Mikroskop (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning), um die gesamte Cochlea optisch zu schneiden. Dieses Mikroskop wurde jedoch nie kommerziell entwickelt; Unser Ziel war es daher, ein Lichtblattmikroskop zu konstruieren, das als Dünnschicht-Laserbildgebungsmikroskop (TSLIM; Abbildung 2). Die Design- und Konstruktionsdetails für TSLIM wurden bereits veröffentlicht⁸. TSLIM hat gegenüber dem OPFOS mehrere Verbesserungen vorgenommen, darunter die Verwendung einer Low-Light-Digitalkamera im Vergleich zu einer CCD-Kamera für die Bilderfassung, optisch codierte Mikropositionierer für eine genaue und reproduzierbare Bewegung der Probe durch das Lichtblatt, die Verwendung einer kommerziell erhältlichen, optisch klaren Probenkammer und die Rhodaminfärbung in Ethanol statt in der Klärlösung, um Fleckenausfällungen im Gewebe zu verhindern. Die kommerzielle Entwicklung von Lichtblattmikroskopen wie SPIM⁶ konzentrierte sich auf die hochauflösende Bildgebung von lebenden, kleinen, transparenten Proben, die jedoch für die Bildgebung der gesamten Cochlea ungeeignet sind, da sie keinen ausreichenden Arbeitsabstand haben. Ein Überblick über die Entwicklung anderer Lichtblattmikroskope wurde von Santi⁷ veröffentlicht. Der Hauptvorteil von TSLIM gegenüber anderen histologischen Methoden zur Untersuchung der Cochlea besteht darin, Gewebe für die 3D-Rekonstruktion optisch zu schneiden und gleichzeitig die Integrität der Probe zu erhalten, so dass sie mit anderen histologischen Methoden verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil der TSLIM-Bildgebung besteht darin, dass nur eine dünne Lichtschicht, die von einem Laser erzeugt wird, dem Gewebe ausgesetzt wird, verglichen mit der Belichtung des gesamten Gewebes mit dem Laser wie bei der konfokalen Mikroskopie. Die Gewebereinigung zur Minimierung der Lichtstreuung und die Tatsache, dass nur ein kleiner Teil des Gewebes dem Laser ausgesetzt ist, führt zu einem minimalen Fluorochrom-Fading (Photobleichen) bei der Lichtblatt-Laserbildgebung. Der Prozess der Fixierung, Dehydrierung und Klärung verändert jedoch die Morphologie der Cochlea-Strukturen und führt zu einer Gewebeschrumpfung im Vergleich zu lebendem Gewebe. Das tatsächliche Ausmaß der auftretenden Gewebeschrumpfung wurde nicht bestimmt.

TSLIM wurde von Shane Johnson und acht deutschen Studenten der Optischen Technik entwickelt (siehe Danksagung). Details zur TSLIM-Konstruktion wurden von Santi et ^al.8 und eine Scan-Version (sTSLIM) von Schröter et ^al.9 zur Verfügung gestellt. TSLIM fungiert als zerstörungsfreies Mikrotom zum optischen Schneiden von Proben und als Mikroskop zum Sammeln von 2D-Serienschnitten über die gesamte Breite und Dicke der Cochlea. TSLIM kann sowohl kleine (mm) als auch große (cm) dicke Proben abbilden. Die Linsen sind luftmontiert, um große Arbeitsabstände mit Sammelobjektiven von 1x und 2x auf einem Dissektionsmikroskop zu ermöglichen. Das Dissektionsmikroskop verfügt außerdem über eine Zoomoptik, die es TSLIM ermöglicht, subzelluläre und synaptische Strukturen auf Zellen aufzulösen. TSLIM ist sowohl mit einem blauen (473 nm) als auch mit einem grünen (532 nm) Laser für die Beleuchtung ausgestattet, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Fluoreszenzsonden für die Bildgebung zu verwenden. Das Ziel von TSLIM ist es, gut ausgerichtete optische 2D-Schnitte durch eine ganze Cochlea für eine vollständige digitale Rekonstruktion von Cochlea-Geweben zu erzeugen. Da es sich um eine Fluoreszenzmethode handelt, können auch Liganden und Immunhistochemie verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu identifizieren.

Ursprünglich wurde eine zylindrische Linse verwendet, um zwei gegenüberliegende Gaußsche Lichtblätter zu erzeugen, aber sie erzeugte Absorptionsbildgebungsartefakte. Aufgrund der Arbeit von Keller et ^al.10 wurde die feste zylindrische Linse durch einen scannenden Galvanometerspiegel ersetzt, um das Lichtblatt⁹ herzustellen. Da die Mitte des Lichtblatts an der Strahltaille am dünnsten ist, werden sTSLIM 2D-Bilder erzeugt, indem eine Zusammenstellung von Datenspalten der X-Achse über die Breite der Probe gesammelt wird (Abbildung 3). Diese Methode wurde erstmals von Buytaert und Dircks¹¹ beschrieben. Die kundenspezifische TSLIM-Software zum Steuern und Sammeln von Bildern wurde unter Verwendung eines grafischen Programms zur Instrumentensteuerung entwickelt. Das Lichtblatt wandert durch die Probe und beleuchtet eine fluoreszierende Ebene innerhalb des Gewebes. Diese fluoreszierende Ebene wird orthogonal durch die transparente Probe projiziert und von einem Dissektionsmikroskop gesammelt. Optisch kodierte Mikropositionierer ermöglichen das Scannen durch die Strahltaille in der X-Achse, um ein einzelnes zusammengesetztes 2D-Bild zu erfassen, und anschließend bewegt der Mikropositionierer der Z-Achse die Probe in eine tiefere Ebene innerhalb des Gewebes, um einen Stapel serieller, geschnittener 2D-Bilder zu erhalten (Video 1, Abbildung 4). Ein Stapel von Translationsbildern wird über die gesamte Breite, Dicke und Länge der Cochlea gesammelt, und das Zusammenfügen von Bildern ist nicht erforderlich (Video 2). Der Bildstapel wird auf einen anderen Computer übertragen und zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm geladen. Die Bildstapel enthalten alle digitalen Informationen über die Morphologie einer Cochlea bei der Auflösung des Mikroskops. Wenn jedoch eine höhere Auflösung erforderlich ist, kann die intakte Cochlea durch destruktive histologische Methoden wie Mikrotomschnitt, Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie weiterverarbeitet werden.

Das 3D-Rendering-Programm wird verwendet, um verschiedene Cochlea-Strukturen für das 3D-Rendering und die quantitative Analyse zu segmentieren. Für die Segmentierung wird jede Struktur in jedem 2D-Bild des Stapels mit einem Grafiktablett und einem Stift in einer anderen Farbe nachgezeichnet (Abbildung 5). Bis heute wurden 20 verschiedene Cochlea-Strukturen segmentiert (Abbildung 6). Nach der Segmentierung können verschiedene 3D-Analysen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine 3D-Rendering-Software die Cochlea in jeder Ebene entlang des Schwerpunkts der Struktur virtuell resektionieren. Video 3 zeigt den Schnitt tangential zum Corti-Organ, der die Haarzellen entlang der Länge der Basilarmembran freilegt. Dieser Prozess erfordert zunächst eine manuelle Segmentierung der interessierenden Struktur. Als nächstes wird der Schwerpunkt der Struktur basierend auf der Anpassung der kleinsten Quadrate von Spline-Punkten berechnet, die entlang der Mitte der Struktur von ihrer Basis bis zu ihrem Scheitelpunkt platziert sind, wodurch eine Annäherung an die Länge der Struktur ermöglicht wird (Video 4). Ein ähnlicher Prozess, der als Skelettierung bezeichnet wird, kann verwendet werden, um die radiale Breite der Struktur entlang ihrer Länge mithilfe einer Farbkarte zu visualisieren (Video 4). Das Gesamtvolumen jeder Struktur wird vom Programm nach der Segmentierung berechnet, aber relative Abstände können auch quantifiziert und mit Farbkarten in einer 3D-Rendering-Software visualisiert werden (Abbildung 7). Segmentierte Strukturen können auch exportiert werden, um vergrößerte Renderings von Volumenkunststoffmodellen zu erzeugen (Abbildung 8). Darüber hinaus kann die halbautomatische Zellzählung auch mit einer 3D-Rendering-Software durchgeführt werden (Abbildung 9). Immunhistochemie und Ligandenbindung können verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu färben, und diese Strukturen können von anderen Cochlea-Strukturen für morphometrische Beurteilungen, wie z. B. die Erstellung eines Zytocochleogramms, isoliert werden (Abbildung 10). Länge, Breite, Oberfläche, Volumen und Anzahl aller Cochlea-Strukturen können aus den 3D-Modellen bestimmt werden, wodurch sich dieser Ansatz ideal für die Kartierung von Cochlea-Schäden auf funktionelle Beeinträchtigungen eignet. Konkret können Cochlea-Schäden durch Alterung, lärmbedingte Traumata oder andere Beleidigungen in 3D-Cochlea-Rekonstruktionen aus optischen 2D-Schnitten dargestellt und quantifiziert werden. Sobald eine Cochlea digitalisiert wurde, gibt es zahlreiche bildgebende Algorithmen, mit denen die Cochlea-Schädigung von Geweben innerhalb der Cochlea im anatomischen Register zu anderen Cochlea-Geweben beurteilt werden kann.