Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

Het slakkenhuis is het perifere sensorische orgaan voor het gehoor bij zoogdieren. Het heeft een complexe spiraalvormige anatomie van herhalende sensorische en ondersteunende cellen die anatomisch gespecialiseerd zijn om geluidstrillingen te detecteren en deze naar de hersenen door te geven voor de perceptie van het gehoor. De belangrijkste sensorische elementen zijn de binnenste en buitenste haarcellen en hun innervervende zenuwvezels waarvan de cellichamen het spiraalvormige ganglion vormen, dat zich in het kanaal van Rosenthal bevindt (figuur 1). Deze sensorische en neurale structuren zijn tonotopisch zo gerangschikt dat hoogfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochleaire basis en laagfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochlea apex². Een anatomische kaart van deze sensorische celverdeling langs de spiraallengte van het ondersteunende basilaire membraan wordt een cytocochleogram³ genoemd en kan worden vergeleken met gehoorverlies als functie van de frequentie zoals afgebeeld in een audiogram.

Het vliezige labyrint van het slakkenhuis, dat is omgeven door dicht bot, maakt het technisch moeilijk om meer dan één cochleaire structuur tegelijk te onderzoeken. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van een lichtplaatmicroscoop om goed uitgelijnde seriële secties van het volledige slakkenhuis te produceren, zodat alle cochleaire structuren ten opzichte van elkaar kunnen worden onderzocht in 3D-reconstructies. Voie et ^al.4 en Voie en Spelman⁵ ontwierpen de eerste lichtplaatmicroscoop, genaamd orthogonal plane fluorescence optical sectioning (OPFOS) microscoop, om het hele slakkenhuis optisch te snijden. Deze microscoop is echter nooit commercieel ontwikkeld; Ons doel was dus om een lichtplaatmicroscoop te construeren die een thin sheet laser imaging microscope (TSLIM; Figuur 2). De ontwerp- en constructiedetails voor TSLIM zijn eerder gepubliceerd⁸. TSLIM heeft verschillende verbeteringen aangebracht ten opzichte van de OPFOS, waaronder het gebruik van een digitale camera bij weinig licht versus een CCD-camera voor het verzamelen van afbeeldingen, optisch gecodeerde micropositioners voor nauwkeurige en reproduceerbare beweging van het monster door de lichtplaat, het gebruik van een in de handel verkrijgbare, optisch heldere monsterkamer en Rhodamine-kleuring in ethanol in plaats van in de opruimoplossing om vlekneerslag in het weefsel te voorkomen. Commerciële ontwikkeling van lichtplaatmicroscopen zoals SPIM⁶ hebben zich gericht op hoge-resolutie beeldvorming van levende, kleine transparante monsters, maar zijn niet geschikt voor hele cochleaire beeldvorming omdat ze onvoldoende werkafstand hebben. Een overzicht van de ontwikkeling van andere lichtplaatmicroscopen werd gepubliceerd door Santi⁷. Het belangrijkste voordeel van TSLIM ten opzichte van andere histologische methoden om het slakkenhuis te onderzoeken, is het optisch doorsneden van weefsels voor 3D-reconstructie met behoud van de integriteit van het monster, zodat het kan worden gebruikt door andere histologische methoden. Een ander voordeel van TSLIM-beeldvorming is dat alleen een dunne lichtplaat geproduceerd door een laser wordt blootgesteld aan het weefsel, vergeleken met blootstelling van hele weefseldikte aan de laser zoals bij confocale microscopie. Weefselverwijdering om lichtverstrooiing te minimaliseren en het feit dat slechts een klein deel van het weefsel aan de laser wordt blootgesteld, resulteert in minimale fluorochroomvervaging (fotobleaching) met light-sheet laserbeeldvorming. Het proces van fixatie, uitdroging en clearing verandert echter de morfologie van cochleaire structuren en resulteert in weefselkrimp in vergelijking met levend weefsel. De werkelijke hoeveelheid weefselkrimp die optreedt, is niet bepaald.

TSLIM is ontwikkeld door Shane Johnson en acht Duitse studenten optische techniek (zie Dankbetuigingen). TSLIM constructiedetails werden verstrekt door Santi et ^al.8 en een scanversie (sTSLIM) door Schröter et ^al.9. TSLIM functioneert als een niet-destructief microtoom om specimens optisch te snijden en als een microscoop om 2D-seriële secties te verzamelen over de volledige breedte en dikte van het slakkenhuis. TSLIM kan zowel kleine (mm) als grote (cm), dikke exemplaren in beeld brengen. Lenzen zijn in de lucht gemonteerd om lange werkafstanden mogelijk te maken met verzamelobjectieven van 1x en 2x op een dissectiemicroscoop. De dissectiemicroscoop heeft ook zoomoptiek waarmee TSLIM subcellulaire en synaptische structuren op cellen kan oplossen. TSLIM is uitgerust met zowel een blauwe (473 nm) als groene (532 nm) laser voor verlichting waarmee een verscheidenheid aan fluorescerende sondes kan worden gebruikt voor beeldvorming. Het doel van TSLIM is om goed uitgelijnde 2D optische secties te produceren door een heel slakkenhuis voor een volledige digitale reconstructie van cochleaire weefsels. Omdat het een fluorescerende methode is, kunnen liganden en immunohistochemie ook worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te identificeren.

Aanvankelijk werd een cilindrische lens gebruikt om twee tegengestelde Gaussische lichtplaten te produceren, maar het produceerde absorptiebeeldartefacten. Door het werk van Keller et ^al.10 werd de vaste cilindrische lens vervangen door een scanning galvanometer spiegel om het lichtblad⁹ te produceren. Aangezien het midden van het lichtblad het dunst is bij de taille van de bundel, worden sTSLIM 2D-beelden bovendien geproduceerd door een samenstelling van X-as kolommen met gegevens over de breedte van het monster te verzamelen (figuur 3). Deze methode werd voor het eerst beschreven door Buytaert en Dircks¹¹. TSLIM aangepaste software voor het aansturen en verzamelen van beelden is ontwikkeld met behulp van een grafisch programma voor instrumentbesturing. Het lichtblad reist door het monster en verlicht een fluorescerend vlak in het weefsel. Dit fluorescerende vlak wordt orthogonaal door het transparante monster geprojecteerd en wordt verzameld door een dissectiemicroscoop. Optisch gecodeerde micropositioners maken het mogelijk om door de straaltaille in de X-as te scannen om een enkel samengesteld 2D-beeld te verzamelen en vervolgens verplaatst de Z-as micropositioner het monster naar een dieper vlak in het weefsel om een stapel seriële, doorsnedede 2D-beelden te verkrijgen (Video 1, Figuur 4). Een stapel translationele afbeeldingen wordt verzameld over de gehele breedte, dikte en lengte van het slakkenhuis en het naaien van afbeeldingen is niet vereist (video 2). De afbeeldingsstapel wordt overgebracht naar een andere computer en geladen in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering. De beeldstapels bevatten alle digitale informatie over de morfologie van een slakkenhuis bij de resolutie van de microscoop. Als echter een hogere resolutie vereist is, kan het intacte slakkenhuis verder worden verwerkt door destructieve histologische methoden zoals microtoomsectie, scannen en transmissie-elektronenmicroscopie.

Het 3D-renderingprogramma wordt gebruikt om verschillende cochleaire structuren te segmenteren voor 3D-rendering en kwantitatieve analyse. Voor segmentatie wordt elke structuur in elke 2D-afbeelding van de stapel met een andere kleur overgetrokken door een grafisch tablet en pen (afbeelding 5). Tot op heden zijn 20 verschillende cochleaire structuren gesegmenteerd (figuur 6). Na segmentatie kunnen verschillende 3D-analyses worden uitgevoerd. 3D-renderingsoftware kan bijvoorbeeld het slakkenhuis virtueel resectieren in elk vlak langs het centrum van de structuur. Video 3 toont secties die raken aan het orgaan van Corti, waardoor de haarcellen over de lengte van het basilaire membraan worden onthuld. Dit proces vereist eerst handmatige segmentatie van de structuur van belang. Vervolgens wordt de centroïde van de structuur berekend op basis van de kleinste vierkanten die passen bij splinepunten die langs het midden van de structuur van de basis tot de top zijn geplaatst, waardoor een benadering van de lengte van de structuur mogelijk is (Video 4). Een soortgelijk proces genaamd skeletonisatie kan worden gebruikt om de radiale breedte van de structuur over de lengte te visualiseren met behulp van een kleurenkaart (Video 4). Het totale volume van elke structuur wordt na segmentatie door het programma berekend, maar relatieve afstanden kunnen ook worden gekwantificeerd en gevisualiseerd met kleurenkaarten in een 3D-renderingsoftware (figuur 7). Gesegmenteerde structuren kunnen ook worden geëxporteerd om vergrote, massief-plastic modelweergaven te produceren (figuur 8). Daarnaast kan semi-geautomatiseerde celtelling ook worden uitgevoerd met behulp van 3D-renderingsoftware (figuur 9). Immunohistochemie en ligandbinding kunnen worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te kleuren en deze structuren kunnen worden geïsoleerd van andere cochleaire structuren voor morfometrische beoordeling, zoals het produceren van een cytocochleogram (figuur 10). Lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal van alle cochleaire structuren kunnen worden bepaald uit de 3D-modellen, waardoor deze aanpak ideaal is voor het in kaart brengen van cochleaire schade aan functionele beperkingen. In het bijzonder kan cochleaire schade als gevolg van veroudering, door lawaai veroorzaakt trauma of andere beledigingen worden getoond en gekwantificeerd in 3D-cochleaire reconstructies van 2D-optische secties. Zodra een slakkenhuis is gedigitaliseerd, zijn er tal van beeldvormingsalgoritmen die kunnen worden gebruikt om cochleaire schade van elk weefsel in het slakkenhuis in het anatomische register aan andere cochleaire weefsels te beoordelen.