تصوير قوقعة الشيخوخة باستخدام المجهر الفلوري ذو الصفيحة الضوئية
Summary
تم تطوير مجهر ورقة ضوئية لتصوير ورقمنة القوقعة بأكملها.
Abstract
الصمم هو الضعف الحسي الأكثر شيوعا ، حيث يؤثر على حوالي 5٪ أو 430 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وفقا لمنظمة الصحة العالمية1. الشيخوخة أو الصمم الشيخوخي هو السبب الرئيسي لفقدان السمع الحسي العصبي ويتميز بتلف خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) والأوعية الدموية السطورية. توجد هذه التراكيب داخل القوقعة ، التي لها تشريح معقد حلزوني الشكل من الأنسجة الغشائية المعلقة في السائل والمحاطة بالعظام. هذه الخصائص تجعل من الصعب تقنيا التحقيق في التغيرات النسيجية المرضية وقياسها. ولتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير مجهر ضوئي (TSLIM) يمكنه تصوير القوقعة بأكملها ورقمنتها لتسهيل دراسة العلاقات بين البنية والوظيفة في الأذن الداخلية. تؤدي المقاطع التسلسلية المحاذاة جيدا للقوقعة بأكملها إلى كومة من الصور لتقديم حجم ثلاثي الأبعاد (3D) وتجزئة الهياكل الفردية للتصور ثلاثي الأبعاد والتحليل الكمي (أي الطول والعرض والسطح والحجم والعدد). تتطلب القوقعة الحد الأدنى من خطوات المعالجة (التثبيت ، وإزالة الكلس ، والجفاف ، والتلوين ، والمقاصة البصرية) ، وكلها متوافقة مع التصوير عالي الدقة اللاحق عن طريق المسح المجهري الإلكتروني وإرساله. نظرا لوجود جميع الأنسجة في المداخن ، يمكن تقييم كل هيكل بشكل فردي أو بالنسبة للهياكل الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن التصوير يستخدم مجسات الفلورسنت ، يمكن استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية وربط الرباط لتحديد هياكل معينة وحجمها أو توزيعها 3D داخل القوقعة. هنا استخدمنا TSLIM لفحص القوقعة من الفئران المسنة لتحديد فقدان خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام التحليلات المتقدمة (على سبيل المثال ، التحليل العنقودي) لتصور التخفيضات المحلية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية في قناة روزنتال على طول حجمها 3D. توضح هذه الأساليب قدرة المجهر TSLIM على تحديد العلاقات بين البنية والوظيفة داخل القوقعة وفيما بينها.
Introduction
القوقعة هي العضو الحسي المحيطي للسمع في الثدييات. يحتوي على تشريح حلزوني معقد لتكرار الخلايا الحسية والداعمة المتخصصة تشريحيا للكشف عن الاهتزازات الصوتية ونقلها إلى الدماغ لإدراك السمع. العناصر الحسية الرئيسية هي خلايا الشعر الداخلية والخارجية وأليافها العصبية المعصبة التي تشكل أجسامها الخلوية العقدة الحلزونية التي تقع داخل قناة روزنتال (الشكل 1). يتم ترتيب هذه الهياكل الحسية والعصبية بشكل صوتي بحيث يتم تحويل الأصوات عالية التردد في قاعدة القوقعة ويتم تحويل الأصوات منخفضة التردد في قمة القوقعة2. تسمى الخريطة التشريحية لتوزيع الخلايا الحسية على طول الطول الحلزوني للغشاء القاعدي الداعم مخطط القوقعةالخلوي 3 ويمكن مقارنتها بفقدان السمع كدالة للتردد كما هو موضح في مخطط السمع.
المتاهة الغشائية للقوقعة ، المحاطة بعظام كثيفة ، تجعل من الصعب تقنيا فحص أكثر من بنية قوقعة واحدة في وقت واحد. لذلك ، فإن الأساس المنطقي لتطوير مجهر ورقة الضوء هو إنتاج مقاطع تسلسلية محاذاة بشكل جيد من القوقعة الكاملة بحيث يمكن فحص جميع هياكل القوقعة بالنسبة لبعضها البعض في عمليات إعادة البناء 3D. صمم Voie et al.4 و Voie and Spelman5 أول مجهر للصفائح الضوئية ، يسمى مجهر المقطع البصري الفلوري المستوي المتعامد (OPFOS) ، لتقسيم القوقعة بأكملها بصريا. ومع ذلك ، لم يتم تطوير هذا المجهر تجاريا. لذلك ، كان هدفنا هو بناء مجهر ورقة ضوئية يسمى مجهر التصوير بالليزر ذو الألواح الرقيقة (TSLIM; الشكل 2). تم نشر تفاصيل التصميم والبناء ل TSLIM سابقا8. أجرى TSLIM العديد من التحسينات على OPFOS ، بما في ذلك استخدام كاميرا رقمية منخفضة الإضاءة مقابل كاميرا CCD لجمع الصور ، وأجهزة تحديد المواقع الدقيقة المشفرة بصريا لحركة دقيقة وقابلة للتكرار للعينة من خلال ورقة الضوء ، واستخدام غرفة عينة متاحة تجاريا وواضحة بصريا ، وتلطيخ Rhodamine في الإيثانول بدلا من محلول المقاصة لمنع ترسيب البقع داخل الأنسجة. ركز التطوير التجاري للمجاهر ذات الألواح الضوئية مثل SPIM6 على التصوير عالي الدقة للعينات الحية الصغيرة الشفافة ولكنها غير مناسبة لتصوير القوقعة بأكملها لأنها تفتقر إلى مسافة العمل الكافية. تم نشر مراجعة لتطوير المجاهر الضوئية الأخرى بواسطة Santi7. الميزة الأساسية ل TSLIM على الطرق النسيجية الأخرى لفحص القوقعة هي تقسيم الأنسجة بصريا لإعادة بناء 3D مع الحفاظ على سلامة العينة بحيث يمكن استخدامها من قبل الطرق النسيجية الأخرى. ميزة أخرى للتصوير TSLIM هي أن ورقة الضوء الرقيقة التي ينتجها الليزر فقط هي التي تتعرض للأنسجة ، مقارنة بتعرض سمك الأنسجة بالكامل لليزر كما هو الحال في الفحص المجهري متحد البؤر. يؤدي تنظيف الأنسجة لتقليل تشتت الضوء وحقيقة تعرض جزء صغير فقط من الأنسجة لليزر إلى الحد الأدنى من تلاشي الفلوروكروم (التبييض الضوئي) باستخدام التصوير بالليزر بالضوء. ومع ذلك، فإن عملية التثبيت والجفاف والتطهير تغير مورفولوجيا هياكل القوقعة وتؤدي إلى انكماش الأنسجة مقارنة بالأنسجة الحية. لم يتم تحديد الكمية الفعلية لانكماش الأنسجة الذي يحدث.
تم تطوير TSLIM من قبل شين جونسون وثمانية طلاب هندسة بصرية ألمان (انظر شكر وتقدير). تم توفير تفاصيل بناء TSLIM بواسطة Santi et al.8 ونسخة مسح (sTSLIM) بواسطة Schröter et al.9. يعمل TSLIM كميكروتوم غير مدمر لعينات المقطع البصري وكمجهر لجمع المقاطع التسلسلية 2D من خلال العرض الكامل وسمك القوقعة. يمكن ل TSLIM تصوير عينات صغيرة (مم) وكبيرة (سم). يتم تثبيت العدسات بالهواء للسماح بمسافات عمل طويلة مع أهداف تجميع 1x و 2x على مجهر التشريح. يحتوي مجهر التشريح أيضا على بصريات تكبير تسمح ل TSLIM بحل الهياكل تحت الخلوية والمشبكية على الخلايا. تم تجهيز TSLIM بليزر أزرق (473 نانومتر) وأخضر (532 نانومتر) للإضاءة يسمح باستخدام مجموعة متنوعة من مجسات الفلورسنت للتصوير. الهدف من TSLIM هو إنتاج مقاطع بصرية 2D محاذاة بشكل جيد من خلال قوقعة كاملة لإعادة بناء رقمية كاملة لأنسجة القوقعة. نظرا لأنها طريقة فلورية ، يمكن أيضا استخدام الروابط والكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد هياكل قوقعة الأذن المحددة.
في البداية ، تم استخدام عدسة أسطوانية لإنتاج ورقتين ضوئيتين غاوسيتين متعارضتين ، لكنها أنتجت قطعا أثرية لتصوير الامتصاص. بسبب عمل Keller et al.10 ، تم استبدال العدسة الأسطوانية الثابتة بمرآة جلفانومتر المسح لإنتاج ورقة الضوء9. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن مركز ورقة الضوء هو الأنحف عند خصر الشعاع ، يتم إنتاج صور sTSLIM 2D من خلال جمع مركب من أعمدة المحور X للبيانات عبر عرض العينة (الشكل 3). تم وصف هذه الطريقة لأول مرة بواسطة Buytaert و Dircks11. تم تطوير برنامج TSLIM المخصص لقيادة الصور وجمعها باستخدام برنامج رسومي للتحكم في الأداة. تنتقل ورقة الضوء عبر العينة وتضيء مستوى الفلورسنت داخل النسيج. يتم إسقاط هذا المستوى الفلوري بشكل متعامد من خلال العينة الشفافة ويتم جمعه بواسطة مجهر تشريح. تسمح المواضع الدقيقة المشفرة بصريا بالمسح الضوئي من خلال خصر الشعاع في المحور X لجمع صورة ثنائية الأبعاد مركبة واحدة ، وبعد ذلك ، يقوم جهاز تحديد الموضع المجهري للمحور Z بنقل العينة إلى مستوى أعمق داخل الأنسجة للحصول على كومة من الصور التسلسلية ثنائية الأبعاد (الفيديو 1 ، الشكل 4). يتم جمع كومة من الصور الانتقالية من خلال عرض القوقعة وسمكها وطولها بالكامل ، ولا يلزم خياطة الصور (الفيديو 2). يتم نقل مكدس الصور إلى كمبيوتر آخر وتحميله في برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي. تحتوي مكدسات الصور على جميع المعلومات الرقمية حول مورفولوجيا القوقعة بدقة المجهر. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى دقة أعلى ، فيمكن معالجة القوقعة السليمة بشكل أكبر عن طريق الطرق النسيجية المدمرة مثل التقسيم المجهري للميكروتوم والمسح والمجهر الإلكتروني النافذ.
يستخدم برنامج تقديم 3D لتقسيم هياكل القوقعة المختلفة لتقديم 3D والتحليل الكمي. للتجزئة ، يتم تتبع كل بنية في كل صورة 2D من المكدس باستخدام لون مختلف بواسطة لوحة رسومات وقلم (الشكل 5). حتى الآن، تم تقسيم 20 بنية قوقعة مختلفة (الشكل 6). بعد التجزئة ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من تحليلات 3D. على سبيل المثال ، يمكن لبرنامج تقديم 3D استئصال القوقعة فعليا في أي مستوى على طول السنترويد للهيكل. يوضح الفيديو 3 تقسيما عرضيا لعضو كورتي ، والذي يكشف عن خلايا الشعر على طول الغشاء القاعدي. تتطلب هذه العملية أولا تجزئة يدوية لهيكل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم حساب النقطه الوسطى للهيكل بناء على ملاءمة المربعات الصغرى لنقاط الشريحة الموضوعة على طول مركز الهيكل من قاعدته إلى قمته ، مما يسمح بتقريب طول الهيكل (الفيديو 4). يمكن استخدام عملية مماثلة تسمى الهيكل العظمي لتصور العرض الشعاعي للهيكل على طوله باستخدام خريطة ملونة (فيديو 4). يتم حساب الحجم الإجمالي لكل هيكل بواسطة البرنامج بعد التجزئة ، ولكن يمكن أيضا قياس المسافات النسبية وتصورها باستخدام خرائط ملونة في برنامج عرض 3D (الشكل 7). يمكن أيضا تصدير الهياكل المجزأة لإنتاج عروض نماذج بلاستيكية صلبة موسعة (الشكل 8). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء عد الخلايا شبه الآلي باستخدام برنامج تقديم 3D (الشكل 9). يمكن استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية وربط الربيطة لتلطيخ هياكل قوقعة الأذن المحددة ويمكن عزل هذه الهياكل عن هياكل القوقعة الأخرى للتقييم المورفومتري مثل إنتاج مخطط قوقعة خلوي (الشكل 10). يمكن تحديد الطول والعرض والسطح والحجم وعدد جميع هياكل القوقعة من نماذج 3D ، مما يجعل هذا النهج مثاليا لرسم خرائط تلف القوقعة إلى الإعاقات الوظيفية. على وجه التحديد ، يمكن إظهار تلف القوقعة بسبب الشيخوخة أو الصدمات الناجمة عن الضوضاء أو غيرها من الإهانات وقياسها في عمليات إعادة بناء القوقعة 3D من الأقسام البصرية 2D. بمجرد رقمنة قوقعة الأذن، هناك العديد من خوارزميات التصوير التي يمكن استخدامها لتقييم تلف قوقعة الأذن لأي نسيج داخل القوقعة في السجل التشريحي لأنسجة القوقعة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقسيم البصري بواسطة المجهر الضوئي لفحص هياكل القوقعة ليس مدمرا ميكانيكيا مثل الطرق النسيجية التقليدية الأخرى ، ويوفر رؤية رقمية كاملة لهياكل القوقعة بالنسبة لبعضها البعض. قدمت الطرق السابقة مثل الاستعدادات السطحية لجهاز Corti14 خريطة لفقدان خلايا الشعر على طول الغشاء القاع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث بمنح من المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى التابعة للمعاهد الوطنية للصحة ، ومؤسسة Kellogg ، والتبرعات الخاصة من بريدجيت سبيرل وجون ماكورميك. تم تطوير TSLIM بمساعدة ممتازة من ماتياس هيلينبراند ، وكيرستين جون ، ومايكي لاوين ، وميشيل لاهير ، وتوبياس شروتر ، وبيتر شاخت ، وأوليفر دانبرغ ، وجوليان ويستر من الجامعة التقنية في إلميناو ، ألمانيا ، تحت إشراف مرشديهم (ستيفان سينزينغر ورينيه ثيسكا) وجيمس ليجر.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
