İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi

Tüm yöntemler ilgili yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmalar için kullanılan tüm insan kalpleri nakledilemezdi ve Amerika Birleşik Devletleri’ndeki (ABD) kadavra organ bağışçılarından bilgilendirilmiş yasal onay (birinci kişi veya yakın akraba) ile etik olarak elde edildi. Kurtarma protokolleri ve in vitro deneyler, ABD Organ Tedarik Nakli Ağı (OPTN) içindeki nakil merkezlerindeki Kurumsal İnceleme Kurulları (IRB’ler) tarafından önceden onaylanmıştır. Ayrıca, donör kalplerinin tüm transferleri tamamen izlenebilir ve ABD federal yetkilileri tarafından periyodik olarak gözden geçirilir. NOT: Bu protokolün yürütülmesi sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman (örn. laboratuvar önlükleri, koruyucu gözlükler, eldivenler) giymek de dahil olmak üzere gerekli tüm güvenlik prosedürlerini uygulayın. 1. Kardiyomiyositlerin izolasyonu (kontraktilite ölçümünden 1 gün önce) Donör kalplerini laboratuvara varır varmaz buz gibi tescilli kardiyoplejik solüsyon6 ile yeniden perfüze edin ve enzimatik olarak yetişkin insan primer miyositlerini ventriküllerdenizole edin 11,12,13,14,15. Daha sonra kardiyomiyositleri süspansiyon halinde tutun ve 10 mL çözelti A (110 mM sükroz, 0.005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM laktobiyonik asit, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurin, 20 mM L-histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutamik asit, 2 mM L- (-) – malik asit, KOH ile pH 7.4) 20 mL Wheaton şişelerinde (Malzeme Tablosu) deneysel olarak sorgulanana kadar soğutulmuş bir sıcaklıkta.NOT: Flakon başına 200.000 hücre saklayın. 2. Laminin kaplama hazırlığı (kontraktiliteyi ölçmeden 1 gün önce) Sekiz oyuklu bir kültür plakasının (Malzeme Tablosu) her bir oyuğuna tek bir cam lamel (25 mm x 25 mm kare, Malzeme Tablosu) yerleştirin. Ardından, lamelleri 5 μg/mL konsantrasyonda laminin ile kaplayın. Bunu yapmak için, 800 μL insan rekombinant Laminin 521 stoğu (Malzeme Tablosu, −20 °C’de saklanır) ila 7.2 mL B çözeltisine (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glikoz ve 10 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4) ekleyin ve iyice karıştırın. 200 μL seyreltilmiş laminin çözeltisini her bir lamel ortasına bırakın. Ardından tabağı kapatın ve 4 °C’lik bir buzdolabında istifleyin.NOT: Yeterli laminin kaplı lamel olduğundan emin olmak için birden fazla sekiz oyuklu kültür plakası hazırlayın. 3.Ca2+-toleranslı kardiyomiyositlerin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün) Buzdolabından bir şişe hücre çıkarın, şişeden çözelti A’yı aspire edin ve soğutulmuş 10 mL B çözeltisi ekleyin.NOT: Hücrelerin emilmediğinden emin olun ve pipeti flakon duvarının üst kısmının içine yerleştirerek B solüsyonunu flakon içine dağıtın. Hücre şişesini kapatın ve ardından hücrelerin B çözeltisi boyunca dağıldığından emin olmak için hafifçe döndürün. Son olarak, hücrelerin oda sıcaklığında (RT) 1 saat oturmasına izin verin. 4. Kayıt sisteminin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün) NOT: Kayıt sistemi, bir sıcaklık kontrol kutusu, stimülatör, bilgisayar kontrollü basınçla çalışan perfüzyon, basınçla çalışan perfüzyon şişeleri, ilgilenilen bölgelerin (ROI’ler) seçilmesine ve kasılma geçişlerinin görüntülenmesine izin veren kurum içi edinim yazılımı, ters mikroskop, hücre odası ve kamera içerir (Şekil 1). Emme vakum sistemini açın. Ardından, mikroskop kapağını çıkarın, açın, kamerayı bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve son olarak kameranın aşırı ısınmamasını sağlamak için fanın açık olduğunu onaylayın. Ardından, mikroskop ısıtma plakasını (Malzeme Tablosu) ve sıcaklık kontrol kutusunu (Malzeme Tablosu, Şekil 1) açın ve uygun çalışma sıcaklığına ayarlayın. Ardından, saha stimülatörünü (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve basınç sistemini açın. Son olarak, çözeltinin borusunu (Malzeme Tablosu) kayıt odasına bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1). 5. Test bileşiklerinin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün) Seyreltik dimetil sülfoksit (DMSO; Malzeme Tablosu) C çözeltisinde 1.000 kat (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glikoz ve 10 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4) % 0.1 DMSO araç çözeltisi yapmak için. Bir bileşiği 0.001 μM’lik terapötik maruziyetinin 1 katı, 100 katı, 100 katı ve 1000 katında test etmek için, test bileşiğini DMSO’da 1 mM’lik bir konsantrasyonda çözün. Üç DMSO stoğu daha üretmek için bu çözeltiyi DMSO ile seri olarak seyreltin (örn., 0.001 mM, 0.01 mM ve 0.1 mM). Son olarak, nihai test konsantrasyonlarını (0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM ve 1 μM) elde etmek için her bir test bileşiği stoğunu 100 mL C çözeltisi içinde 1.000 kat seyreltin. Araç çözeltisini ve bileşiğin nihai mikromolar konsantrasyonlarının çözeltilerini 100 mL cam şişelere ekleyin (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve ardından şişeleri basınçla çalışan perfüzyon sistemine bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1). Ardından, 1,8 mL/dk hızında sabit bir perfüzyon akışı sağlamak için 200-300 mbar’lık bir basınç kullanarak perfüzyon sistemini bilgisayar güdümlü bir programla (Malzeme Tablosu) hazırlayın.NOT: Test bileşiğinin bir çözünürlük sorunuyla ilişkili olduğu tespit edilirse deneyi yapmayın. Ayrıca, hücrelere deneysel uygulamadan önce 30 dakika içinde stok çözeltilerden bileşik test çözeltilerini formüle edin. 6. Kardiyomiyositlerin kaplanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün) 4 ° C’lik buzdolabından laminin kaplı lameller içeren sekiz oyuklu bir plaka alın ve bir lamel çok iyi temizlenmiş bir kayıt odasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1). Ardından, sekiz oyuklu plakayı bir sonraki kaplamaya kadar 4 °C buzdolabına geri koyun.NOT: Lameli ince bir laminin tabakasıyla kaplanmış halde tutarken, kaplanmış lameli silmek için tüy bırakmayan bir mendil (Malzeme Tablosu) kullanın. Ayrıca, kullanılmış lamelleri keskin bir kaba attığınızdan emin olun. Daha sonra, yükseltilmiş bir hücre şişesi alın (adım 3.2) ve hücreleri kaybetmeden (~ 200 μL) mümkün olduğunca küçük bir hacme ulaşmak için şişeden çözelti B’yi aspire edin. Daha sonra, 200 μL’lik hücreleri, ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş kayıt mikroskobu odasına dağıtın (Malzeme Tablosu). Hücrelerin 5 dakika boyunca lamel üzerine yerleşmesine izin verin. Hücrelerin tam olarak yerleşmesini beklerken, mikroskopta görüş alanını açın ve hücre yoğunluğunun deney çalışmasının başlaması için yeterli olup olmadığını (~% 70) belirleyin.NOT: 200 μL’den fazla dağıtılırsa, emişin tüm hücreleri aspire etmediğinden emin olun. 7. Kardiyomiyosit kontraktilitesinin kaydedilmesi Kaplama tamamlandıktan sonra, basınçla çalışan perfüzyon sistemini kullanarak hücreleri C çözeltisi ile sürekli perfüze ederek 5 dakika boyunca dengeleyin (Malzeme Tablosu). Emişi doğru şekilde ayarlayın, hem sıcaklık kontrol kutusunu hem de ısıtma plakasını açın ve ~35 °C verecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, bir alan stimülatörüne bağlı odanın zıt taraflarına yerleştirilmiş bir çift platin tel ile bir alan stimülatörü üzerinde 1 Hz pacing frekansında (3 ms süreli bipolar darbe) eşik üstü voltajla hücreleri uyarın. Uyarıcı nabzın genliğini 1 V’a ayarlayın ve ardından kardiyomiyositler kasılma-gevşeme döngüleri oluşturmaya başlayana kadar artırın. Deneme boyunca 1,5x eşik değeri kullanın.NOT: Çubuk şeklinde morfolojiye ve net çizgilere sahip sağlıklı hücreleri seçin. Ardından, görüş alanını ayarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda daralan hücreyi görünüme getirmeye odaklanın (Şekil 2A). Ardından, optik kasılma kayıt sisteminin toplama yazılımı içindeki hücrelerin sayısallaştırılmış görüntülerini görüntüleyin. Bu yazılım, aynı karede birden fazla miyosit içeren bir video akışını kaydetmek için 150 FPS hızında yüksek çözünürlüklü, yüksek kare hızlı bir kamera kullanır (Malzeme Tablosu, Şekil 1).NOT: Bu, birkaç sağlıklı miyositin sarkomer dinamiklerini aynı anda yakalamak ve ölçmek için yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlük sağlar. Video akışından sarkomer uzunluğundaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak paralel olarak hesaplanmasını sağlamak için modern yüksek çekirdek sayılı işlemcilerden yararlanılır (optik yoğunluk verileri, sağlıklı kardiyomiyositlerin görüntüleri üzerine yerleştirilen ve kasılma eksenine paralel olarak yerleştirilen kullanıcı tanımlı ilgi alanlarından [ROI] toplanır, Şekil 2B). Optik yoğunluk verileri, kardiyomiyositlerin Z çizgilerine karşılık gelen parlak ve koyu bantları gösterir (Şekil 1, Şekil 2C). Son olarak, bu veriler izleme amacıyla kullanıcıya gösterilir ve daha sonra analiz edilmek üzere bir diske kaydedilir (Şekil 2C).Hücrelerin odakta olmayan alanlarından kaçının. Ayrıca, ilaçların uygulanması sırasında hücrelerin kasılmasında meydana gelen değişiklikler, ROI’lerin hücrelerin kasılmasını okuyamamasına neden olabileceğinden, ROI’leri hücrelerin kenarına yakın konumlandırmayın. ROI’lerin seçimi tamamlandığında ve kasılmalar kullanım için gerekli standartları karşıladığında (örneğin, sarkomer kısalması %>1; 1 Hz pacing frekansının uygulanmasıyla ritmik kasılma, aritmik olayların olmaması), bir bileşiğin etkilerini değerlendirmek için deneyi başlatın. Stimülasyon protokolü ve bileşiğin test konsantrasyonlarını uygulama sırası Tablo 1’de gösterilmektedir. Toplama yazılımı, verilerin alınmasını ve görüntülenmesini ve test konsantrasyonlarının ve işlem süresinin etiketlenmesini otomatik bir şekilde yönetecektir.NOT: Kasılma, temel araç periyodunun tamamı boyunca sabit bir genlikte kalırsa test konsantrasyonları uygulayın. Yukarı veya aşağı bir çalışma gösteren hücreleri diskalifiye edin. Ayrıca, deney boyunca perfüzyonun farklı test konsantrasyonlarına geçtiğinden emin olun. Deney ve sunucuda veri depolama tamamlandıktan sonra, perfüzyonu ve ısıtıcıyı kapatın, stimülasyonu durdurun, mikroskop odasını damıtılmış suyla temizleyin, ardından cam lamel çıkarın ve odayı iyice kurulayın.NOT: Bir sonraki hücre setinin herhangi bir bileşiğe zamanından önce maruz kalmasını önlemek ve böylece toplanan verileri geçersiz kılmak için çok önemli olduğundan hazneyi iyice temizleyin. Daha sonra, yeni bir kardiyomiyosit kaplaması yapın ve bileşiğin testini tamamlamak veya yeni bir bileşiğin test edilmesi için yeterli veri elde etmek için ek bir deney yapın. 8. Optik kontraktilite kayıt sisteminin kapatılması Bileşik(ler)in günlük testi tamamlandığında, önce sistemi temizlemek için gerekli olmayan tüm ekipmanı kapatın ve verileri çevrimdışı analiz için kopyalayın. Ardından, son test konsantrasyonlarının çözeltilerini içeren 100 mL’lik cam şişeleri (Malzeme Tablosu) çıkarın ve bunları yarıya kadar RBS 25 Konsantre çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş cam şişelerle değiştirin. RBS solüsyonunu mikroskop odasından 5 dakika geçirin, ardından perfüzyon tüpünü hazneden ayırın, damıtılmış suyla temizleyin ve son olarak iyice kurulayın.NOT: Olası taşmaları önlemek için vakumun iyi çalıştığından emin olun. Ardından, perfüzyon tüpünü drenaj borusuna bağlayın. Basınçla çalışan perfüzyon sisteminin yazılımını (Malzeme Tablosu) kullanarak, basınç ve akış hızının yeterince ayarlandığından emin olarak RBS çözeltisini 10 dakika çalıştırın. Daha sonra, perfüzyon sisteminin temizliğini tamamlamak için 5 dakika boyunca% 1 DMSO perfüze edin ve ardından 15-20 dakika damıtılmış su. Mikroskop ışığını kapatın ve kapağını kapatın. Ardından, kamera kablolarını mikroskobun yan tarafındaki kutudan çıkarın ve fanı kapatın. Kullanılmış tüm şişelerin temizlik ve otoklav için gönderildiğinden emin olun. Son olarak, tüm drenaj kovalarının 1/4 veya daha az dolu olduğundan emin olun.NOT: Ertesi gün kullanmak üzere yeterli laminin kaplı lamel olduğundan emin olun. Son olarak, her kayıt sisteminde yapılan tüm deneylerin edinme klasöründeki dosyaları kopyalayın ve ek çevrimdışı analiz için bunları güvenli bir yedekleme sunucusuna yapıştırın. Ardından, tüm veri dosyalarını alma klasöründen silin. 9. Kasılma verilerinin analizi Verilerin ortalamasını almak için analiz yazılımını ve özel yapım bir makroyu kullanarak çevrimdışı analiz gerçekleştirin. Analiz yazılımı, edinim yazılımı tarafından üretilen sarkomer dinamiği verilerinden çeşitli metrikleri hesaplar ve raporlar. Bu parametrelerin ayrıntılı bir listesi Şekil 2D’de verilmiştir.NOT: Düşük seviyeli yazılım tekniklerinin uygulanması, birçok kayıt çalışmasının 5 saniyede analiz edilmesini sağlar. İlacın neden olduğu kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için temel parametre kontraktilite genliğidir (sarkomer kısalması% = sarkomer uzunluğundaki değişim). Pik kasılma/dinlenme sarkomer uzunluğundaki sarkomer uzunluğu olarak hesaplanır ve her test konsantrasyonu için son 20 kasılma geçişinin ortalaması alınır. Her bir kardiyomiyositin spesifik temel araç kontrol koşuluna göre ortalama kasılma genliği üzerindeki test bileşiğinin etkilerini ölçün. Ortalama sonuçları ortalama ± SEM olarak ifade edin ve test bileşiğinin kasılma genliği üzerindeki konsantrasyon etkisini gösteren bir grafik oluşturun. Daha sonra, IC50 (kasılma genliğinde inhibisyon üreten konsantrasyon) ve EC50 (kasılma genliğinde artış üreten konsantrasyon) değerlerini türetmek için analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanarak konsantrasyon-tepki eğrisini Hill denklemine uydurun. Kasılma genliğine ek olarak, diğer parametreleri de hesaplayabilirsiniz:Kasılma sonrası: Kasılma sonrası, bir sonraki düzenli kasılmadan önce meydana gelen ve anormal ve senkronize olmayan bir kasılma üreten kardiyomiyositin spontan sekonder kasılma geçici olarak tanımlayın. Kasılma başarısızlığı: Kasılma başarısızlığını, elektriksel uyaranın bir kasılmayı indükleyememesi olarak tanımlayın. Kısa süreli değişkenlik (STV) ve alternans: Bu iki parametreyi kasılma genliği değişkenliğinin Poincaré grafiklerinde görselleştirin.STV’yi hesaplayın (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) her kontrol ve test ürünü konsantrasyon periyodunun son 20 geçici olayı ile. Alternansları tekrarlayan dönüşümlü kısa ve uzun kasılma genliği geçici akımları olarak tanımlayın. Pro-aritmi insidansını hesaplamak için, STV değerlerini her hücrenin araç kontrol değerine normalleştirin, kasılma sonrası, kasılma başarısızlığı, STV ve alternansları çizin ve bunları her bir sinyali sergileyen hücrelerin insidansının %’si olarak ifade edin. Ato pik zamanı, gevşeme (Decay 30), gevşeme (Decay 90), gevşeme süresi (TR90) (Şekil 2D), başlangıç sarkomer uzunluğu, pik zamanı, pik yüksekliği, pik kasılmada sarkomer uzunluğu, maksimum kasılma hızı ve maksimum gevşeme hızı12 hesaplaması ile multiparametrik mekanik profillemeyi tamamlayın. Kasılma genliği gibi, bu parametreleri her bir kardiyomiyositin spesifik temel kontrol koşuluna göre ifade edin ve bunları konsantrasyon-yanıt grafiklerinde grafiklendirin.