Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle menschlichen Herzen, die für die Studien verwendet wurden, waren nicht transplantierbar und wurden nach Aufklärung (erste Person oder nächste Angehörige) von Leichenorganspendern in den Vereinigten Staaten (USA) nach Aufklärung gewonnen. Die Genesungsprotokolle und In-vitro-Experimente wurden von Institutional Review Boards (IRBs) in Transplantationszentren innerhalb des US Organ Procurement Transplant Network (OPTN) vorab genehmigt. Darüber hinaus sind alle Transfers der Spenderherzen vollständig rückverfolgbar und werden regelmäßig von den US-Bundesbehörden überprüft. HINWEIS: Wenden Sie während der Ausführung dieses Protokolls alle erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen an, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (z. B. Laborkittel, Schutzbrille, Handschuhe). 1. Isolierung von Kardiomyozyten (1 Tag vor Messung der Kontraktilität) Die Spenderherzen werden sofort nach der Ankunft im Labor mit eiskalter, proprietärer kardioplegikerischer Lösung6 erneut perfundiert und enzymatisch adulte humane primäre Myozyten aus den Ventrikeln11, 12, 13, 14, 15 isoliert. Dann werden die Kardiomyozyten in Suspension gehalten und mit 10 ml Lösung A (110 mM Saccharose, 0,005 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 70 mM KOH, 60 mM Lactobionsäure, 10 mMKH2PO4, 20 mM Taurin, 20 mM L-Histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-Glutaminsäure, 2 mM L-(-)-Brillensäure, pH 7,4 mit KOH) in 20 ml Wheaton-Fläschchen (Materialtabelle) bei gekühlter Temperatur, bis sie experimentell befragt werden.HINWEIS: Lagern Sie 200.000 Zellen pro Durchstechflasche. 2. Vorbereitung der Lamininbeschichtung (1 Tag vor der Messung der Kontraktilität) Legen Sie ein einzelnes Deckglas (25 mm x 25 mm quadratisch, Materialtabelle) in jede Vertiefung einer Acht-Well-Kulturplatte (Materialtabelle). Beschichten Sie dann die Deckgläser mit Laminin in einer Konzentration von 5 μg/ml. Dazu werden 800 μl des humanen rekombinanten Laminin 521-Stamm (Materialtabelle, gelagert bei −20 °C) zu 7,2 ml Lösung B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,4 mit NaOH) gegeben und gut gemischt. Geben Sie 200 μl der verdünnten Lamininlösung in die Mitte jedes Deckglases. Dann den Teller abdecken und im 4 °C warmen Kühlschrank stapeln.HINWEIS: Bereiten Sie mehrere Acht-Well-Kulturplatten vor, um sicherzustellen, dass genügend lamininbeschichtete Deckgläser vorhanden sind. 3. Herstellung von Ca2+-toleranten Kardiomyozyten (am Tag der Messung der Kontraktilität) Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit Zellen aus dem Kühlschrank, saugen Sie Lösung A aus der Durchstechflasche und fügen Sie 10 ml Lösung B hinzu.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht abgesaugt werden, und dispergieren Sie Lösung B in der Durchstechflasche, indem Sie die Pipette auf die Innenseite der Oberseite der Durchstechflasche legen. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit den Zellen und schwenken Sie sie dann vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen in Lösung B verteilt sind. Zum Schluss lassen Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur (RT) ruhen. 4. Vorbereitung des Aufzeichnungssystems (am Tag der Messung der Kontraktilität) HINWEIS: Das Aufzeichnungssystem umfasst eine Temperaturkontrollbox, einen Stimulator, eine computergesteuerte druckgesteuerte Perfusion, druckgesteuerte Perfusionsflaschen, eine hauseigene Erfassungssoftware, die die Auswahl von Regions of Interest (ROIs) und die Anzeige von Kontraktilitätstransienten ermöglicht, ein inverses Mikroskop, eine Zellkammer und eine Kamera (Abbildung 1). Schalten Sie das Saugvakuumsystem ein. Entfernen Sie dann die Mikroskopabdeckung, schalten Sie sie ein, schließen Sie die Kamera an (Materialtabelle, Abbildung 1) und vergewissern Sie sich schließlich, dass der Lüfter eingeschaltet ist, um sicherzustellen, dass die Kamera nicht überhitzt. Schalten Sie dann die Heizplatte des Mikroskops (Materialtabelle) und die Temperaturkontrollbox (Materialtabelle, Abbildung 1) ein und stellen Sie sie auf die richtige Betriebstemperatur ein. Schalten Sie dann den Feldstimulator (Materialtabelle, Abbildung 1) und das Drucksystem ein. Verbinden Sie abschließend den Schlauch der Lösung (Materialtabelle) mit der Aufzeichnungskammer (Materialtabelle, Abbildung 1). 5. Herstellung der Testverbindungen (am Tag der Messung der Kontraktilität) Verdünntes Dimethylsulfoxid (DMSO; Material-Tabelle) 1.000-fach in Lösung C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,4 mit NaOH), um eine0,1%ige DMSO-Vehikellösung herzustellen. Um eine Verbindung mit dem 1-fachen, 10-fachen, 100-fachen und 1000-fachen ihrer therapeutischen Exposition von 0,001 μM zu testen, löst man die Testverbindung in DMSO in einer Konzentration von 1 mM auf. Verdünnen Sie diese Lösung seriell mit DMSO, um drei weitere DMSO-Stammstoffe herzustellen (z. B. 0,001 mM, 0,01 mM und 0,1 mM). Zum Schluss wird jede Testverbindung 1.000-fach in 100 ml Lösung C verdünnt, um die endgültigen Testkonzentrationen (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM und 1 μM) zu erhalten. Geben Sie die Vehikellösung und die Lösungen der mikromolaren Endkonzentrationen der Verbindung in 100-ml-Glasflaschen (Materialtabelle, Abbildung 1) und schließen Sie die Flaschen dann an das druckgesteuerte Perfusionssystem an (Materialtabelle, Abbildung 1). Anschließend wird das Perfusionssystem mit einem computergesteuerten Programm (Materialtabelle) mit einem Druck von 200-300 mbar vorbereitet, um einen konstanten Perfusionsfluss mit einer Rate von 1,8 ml/min zu erzielen.HINWEIS: Führen Sie das Experiment nicht durch, wenn festgestellt wird, dass die Testverbindung mit einem Problem mit der Löslichkeit verbunden ist. Formulieren Sie außerdem die zusammengesetzten Testlösungen aus Stammlösungen innerhalb von 30 Minuten vor der experimentellen Anwendung auf die Zellen. 6. Beschichtung der Kardiomyozyten (am Tag der Messung der Kontraktilität) Nehmen Sie eine Acht-Well-Platte mit lamininbeschichteten Deckgläsern aus dem 4 °C-Kühlschrank und legen Sie ein Deckglas vorsichtig in eine sehr gut gereinigte Aufzeichnungskammer (Abbildung 1). Dann die Acht-Well-Platte bis zum nächsten Anrichten wieder in den 4 °C heißen Kühlschrank stellen.HINWEIS: Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch (Materialtabelle), um das beschichtete Deckglas abzuwischen, während das Deckglas mit einer dünnen Schicht Laminin beschichtet bleibt. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie gebrauchte Deckgläser in einem Behälter für scharfe Gegenstände entsorgen. Nehmen Sie dann eine eskalierte Durchstechflasche mit Zellen (Schritt 3.2) und saugen Sie Lösung B aus der Durchstechflasche ab, um ein möglichst kleines Volumen zu erreichen, ohne Zellen zu verlieren (~200 μl). Als nächstes werden die 200 μl Zellen in die Aufzeichnungsmikroskopkammer gegeben, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops montiert ist (Materialtabelle). Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang auf dem Deckglas ruhen. Während Sie darauf warten, dass sich die Zellen vollständig eingependelt haben, öffnen Sie das Sichtfeld des Mikroskops und stellen Sie fest, ob die Zelldichte ausreichend ist (~70%), damit der Versuchslauf beginnen kann.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nicht alle Zellen abgesaugt werden, wenn mehr als 200 μl abgegeben werden. 7. Erfassung der Kardiomyozyten-Kontraktilität Nach Abschluss der Beschichtung werden die Zellen 5 Minuten lang ins Gleichgewicht gebracht, indem sie kontinuierlich mit Lösung C unter Verwendung des druckgesteuerten Perfusionssystems perfundiert werden (Materialtabelle). Stellen Sie die Absaugung richtig ein, schalten Sie sowohl den Temperaturregler als auch die Heizplatte ein und stellen Sie sie auf ~35 °C ein. Dann werden die Zellen mit einer überschwelligen Spannung bei einer Schrittfrequenz von 1 Hz (bipolarer Impuls von 3 ms Dauer) auf einem Feldstimulator mit einem Paar Platindrähte stimuliert, die auf gegenüberliegenden Seiten der Kammer platziert sind und mit einem Feldstimulator verbunden sind. Stellen Sie die Amplitude des stimulierenden Impulses auf 1 V ein und erhöhen Sie sie dann, bis die Kardiomyozyten beginnen, Kontraktions-Entspannungs-Zyklen zu erzeugen. Verwenden Sie während des gesamten Experiments einen Wert von 1,5x Schwellenwert.HINWEIS: Wählen Sie gesunde Zellen mit stäbchenförmiger Morphologie und deutlichen Streifen aus. Passen Sie dann das Sichtfeld an und konzentrieren Sie sich darauf, so viele kontrahierende Zellen wie möglich in die Ansicht zu bringen (Abbildung 2A). Als nächstes zeigen Sie die digitalisierten Bilder der Zellen in der Erfassungssoftware des optischen Kontraktilitätsaufzeichnungssystems an. Diese Software verwendet eine hochauflösende Kamera mit hoher Bildrate und einer Rate von 150 FPS (Materialtabelle, Abbildung 1), um einen Videostream aufzuzeichnen, der mehrere Myozyten im selben Bild enthält.HINWEIS: Dies bietet eine ausreichende zeitliche und räumliche Auflösung, um die Sarkomerdynamik mehrerer gesunder Myozyten gleichzeitig zu erfassen und zu messen. Moderne High-Core-Count-Prozessoren werden genutzt, um die parallele Berechnung von Änderungen der Sarkomerlänge aus dem Videostream in Echtzeit zu ermöglichen (optische Dichtedaten werden von benutzerdefinierten Regionen von Interesse [ROI] gesammelt, die über den Bildern gesunder Kardiomyozyten und parallel zur Kontraktionsachse platziert werden, Abbildung 2B). Die optischen Intensitätsdaten zeigen helle und dunkle Bänder, die den Z-Linien der Kardiomyozyten entsprechen (Abbildung 1, Abbildung 2C). Abschließend werden diese Daten dem Benutzer zu Überwachungszwecken angezeigt und zur späteren Analyse auf einer Festplatte gespeichert (Abbildung 2C).Vermeiden Sie Bereiche der Zellen, die nicht scharf sind. Positionieren Sie die ROIs auch nicht in der Nähe des Zellrands, da die Veränderungen in der Kontraktion der Zellen während der Anwendung von Medikamenten dazu führen können, dass die ROIs nicht in der Lage sind, die Kontraktion der Zellen zu lesen. Wenn die Auswahl der ROIs abgeschlossen ist und die Kontraktionen die erforderlichen Standards für die Verwendung erfüllen (z. B. Sarkomerverkürzung >1%; rhythmische Kontraktion bei Anwendung einer 1 Hz-Schrittfrequenz, Abwesenheit von arrhythmischen Ereignissen), starten Sie das Experiment, um die Auswirkungen einer Verbindung zu bewerten. Das Stimulationsprotokoll und die Reihenfolge der Anwendung der Testkonzentrationen durch die Verbindung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Erfassungssoftware verwaltet automatisiert die Erfassung und Anzeige von Daten sowie die Markierung von Testkonzentrationen und Behandlungszeiten.ANMERKUNG: Die Prüfkonzentrationen sind anzuwenden, wenn die Kontraktion während des gesamten Basiszeitraums des Fahrzeugs in einer stabilen Amplitude bleibt. Disqualifizieren Sie Zellen, die entweder einen Anlauf oder einen Ablauf anzeigen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Perfusion während des gesamten Experiments auf die verschiedenen Testkonzentrationen umgeschaltet wird. Schalten Sie nach Beendigung des Experiments und der Datenspeicherung auf dem Server die Perfusion und die Heizung aus, stoppen Sie die Stimulation, reinigen Sie die Mikroskopkammer mit destilliertem Wasser, entfernen Sie dann das Deckglas und trocknen Sie die Kammer gründlich ab.HINWEIS: Reinigen Sie die Kammer gründlich, da dies entscheidend ist, um zu vermeiden, dass die nächste Gruppe von Zellen vorzeitig einer Verbindung ausgesetzt wird, wodurch alle gesammelten Daten ungültig werden. Führen Sie als Nächstes eine neue Plattierung von Kardiomyozyten durch und führen Sie ein zusätzliches Experiment durch, um genügend Daten zu erhalten, um die Prüfung der Verbindung abzuschließen oder eine neue Verbindung zu testen. 8. Ausschalten des optischen Kontraktilitätsaufzeichnungssystems Wenn die tägliche Prüfung der Verbindung(en) abgeschlossen ist, schalten Sie zunächst alle Geräte aus, die nicht zur Reinigung des Systems erforderlich sind, und kopieren Sie die Daten für die Offline-Analyse. Als nächstes werden die 100-ml-Glasflaschen (Materialtabelle) mit den Lösungen der endgültigen Testkonzentrationen entfernt und durch Glasflaschen ersetzt, die zur Hälfte mit RBS 25-Konzentratlösung gefüllt sind (Materialtabelle). RBS-Lösung 5 Minuten lang durch die Mikroskopkammer perfundieren, dann den Perfusionsschlauch von der Kammer trennen, mit destilliertem Wasser reinigen und schließlich gründlich trocknen.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Staubsauger gut funktioniert, um eine mögliche Überschwemmung zu vermeiden. Als nächstes verbinden Sie den Perfusionsschlauch mit dem Drainageschlauch. Lassen Sie die RBS-Lösung mit der Software des druckgesteuerten Perfusionssystems (Materialtabelle) 10 Minuten lang laufen und stellen Sie sicher, dass der Druck und die Durchflussrate ausreichend eingestellt sind. Dann 1% DMSO für 5 Minuten und dann destilliertes Wasser für 15-20 Minuten perfundieren, um die Reinigung des Perfusionssystems abzuschließen. Schalten Sie das Licht des Mikroskops aus und setzen Sie die Abdeckung auf. Ziehen Sie dann die Kamerakabel aus der Box an der Seite des Mikroskops und schalten Sie den Lüfter aus. Stellen Sie sicher, dass alle gebrauchten Flaschen zur Reinigung und zum Autoklaven geschickt werden. Stellen Sie schließlich sicher, dass alle Drainageeimer zu 1/4 oder weniger gefüllt sind.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass genügend lamininbeschichtete Deckgläser für die Verwendung am nächsten Tag vorhanden sind. Kopieren Sie abschließend die Dateien im Erfassungsordner aller Experimente, die auf jedem Aufzeichnungssystem durchgeführt wurden, und fügen Sie sie für eine zusätzliche Offline-Analyse in einen sicheren Backup-Server ein. Löschen Sie als Nächstes alle Datendateien aus dem Akquisitionsordner. 9. Analyse von Kontraktilitätsdaten Führen Sie eine Offline-Analyse mit der Analysesoftware und einem benutzerdefinierten Makro durch, um den Durchschnitt der Daten zu bilden. Die Analysesoftware berechnet und meldet verschiedene Metriken aus den von der Erfassungssoftware erzeugten Sarkomerdynamikdaten. Eine detaillierte Liste dieser Parameter ist in Abbildung 2D dargestellt.HINWEIS: Durch die Anwendung von Low-Level-Softwaretechniken können viele Aufzeichnungsläufe in 5 Sekunden analysiert werden. Der wichtigste Parameter zur Beurteilung arzneimittelinduzierter Veränderungen der Kontraktilität ist die Kontraktilitätsamplitude (Sarkomerverkürzung % = Änderung der Sarkomerlänge). Sie wird als Sarkomerlänge bei maximaler Kontraktions-/Ruhesarkomerlänge berechnet und über die letzten 20 Kontraktilitätstransienten für jede Testkonzentration gemittelt. Quantifizieren Sie die Auswirkungen der Testverbindung auf die durchschnittliche Kontraktilitätsamplitude im Verhältnis zu den spezifischen Ausgangsbedingungen der Fahrzeugkontrolle jedes Kardiomyozyten. Die durchschnittlichen Ergebnisse werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt und ein Diagramm erstellt, das den Konzentrationseffekt der Testverbindung auf die Kontraktilitätsamplitude darstellt. Als Nächstes wird die Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit Hilfe der Analysesoftware (Materialtabelle) an die Hill-Gleichung angepasst, um die Werte IC50 (Konzentration, die eine 50%ige Hemmung der Kontraktilitätsamplitude erzeugt) und EC50 (Konzentration, die eine 50%ige Erhöhung der Kontraktilitätsamplitude bewirkt) abzuleiten. Neben der Kontraktilitätsamplitude können Sie auch andere Parameter berechnen:Nachkontraktion: Identifizieren Sie die Nachkontraktion als spontane sekundäre Kontraktionstransiente des Kardiomyozyten, die vor der nächsten regulären Kontraktion auftritt und eine abnormale und unsynchronisierte Kontraktion hervorruft. Kontraktionsfehler: Identifizieren Sie Kontraktionsversagen als die Unfähigkeit des elektrischen Stimulus, eine Kontraktion zu induzieren. Kurzzeitvariabilität (STV) und Alternativen: Visualisieren Sie diese beiden Parameter in Poincaré-Diagrammen der Kontraktionsamplitudenvariabilität.Berechnen Sie den STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) mit den letzten 20 Transienten jeder Kontroll- und Prüflingskonzentrationsperiode. Identifizieren Sie Alternane als sich wiederholende, abwechselnd kurze und lange Kontraktilitätsamplitudentransienten. Um die Inzidenz von Proarrhythmien zu berechnen, normalisieren Sie die STV-Werte auf den Vehikelkontrollwert jeder Zelle, zeichnen Sie Nachkontraktion, Kontraktionsfehler, STV und Alternane auf und drücken Sie sie als Prozentsatz der Inzidenz der Zellen aus, die jedes der Signale aufweisen. Vervollständigen Sie die multiparametrische mechanistische Profilerstellung mit der Berechnung der Zeit Ato peak, des Zerfalls auf 30 % Relaxation (Zerfall 30), des Zerfalls auf 90 % Relaxation (Zerfall 90), der Zeit bis 90 % Relaxation (TR90) (Abbildung 2D), der Basislänge des Sarkomers, der Zeit bis 50 % des Peaks, der Peakhöhe, der Sarkomerlänge bei maximaler Kontraktilität, der maximalen Kontraktionsgeschwindigkeit und der maximalen Relaxationsgeschwindigkeit12. Drücken Sie diese Parameter wie die Kontraktilitätsamplitude relativ zur spezifischen Ausgangskontrollbedingung jedes Kardiomyozyten aus und stellen Sie sie in Konzentrations-Wirkungs-Diagrammen dar.