カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

1.堆肥の準備 便利な供給源から堆肥や庭の土を入手し、空気を入れるために蓋に穴を開けた標準的なキッチンプラスチック容器に実験室内に保管します。ショウジョウバエや他の無脊椎動物を防ぐために、脱脂綿で穴を塞ぎます(図1A)。注:500グラムの土壌(1.5ガロンの容器に収まる、寸法:30 cm x 20 cm x 10 cm)は、12の小宇宙に十分な材料を提供します。 堆肥または土壌を、刻んだ農産物または異なる農産物の混合物を、農産物と土壌の質量比が1:2で濃縮します。 20〜25°Cで7〜14日間インキュベートし、1日1回混合し、必要に応じてM9培地を加えて、濁らせずに水分を維持します。注:農産物が豊富でない土壌は通常、 C.エレガンス の成長をサポートしませんが、使用する特定の農産物は研究者次第であり、ワームの成長をサポートできる多くの種類と混合物があります。さまざまな農産物で濃縮すると、さまざまな方法で細菌群集の多様化が促進され、さまざまな出発点からの腸内細菌叢アセンブリの研究が可能になります(ディスカッションセクションを参照)。 2.堆肥小宇宙の調製 各小宇宙について、スズ箔とオートクレーブで覆われた30 mLのガラスビーカーに10 gの濃縮堆肥を追加します(図1B)。 オートクレーブ処理した堆肥を補充するための微生物抽出物を調製するには、まず、ステップ2.1で使用したのと同じ堆肥30gを3本の50mLチューブのそれぞれに加え、M9を充填します。1分間渦巻きます(図1C)。注:これは、それぞれが数百の線虫の発生をサポートする9つの小宇宙に十分な細菌を提供するはずです。 チューブを560 × g で室温(RT)で5分間遠心分離します。 ペレットを乱さないように注意しながら、血清学的ピペットで上清を取り除き、新しい50mLチューブで混ぜ合わせます。 RTで最高速度(2,000 × g)で15分間遠心分離して細菌抽出物を濃縮します。 ペレットを十分なM9に再懸濁して、各小宇宙に200 μL、さらに200 μLを加えて、小宇宙内のワーム発生の目に見える代理として機能するプレートに追加します。注:たとえば、9つの小宇宙の場合、微生物ペレットを2mLのM9に再懸濁します。 200 μLの濃縮微生物抽出物を、オートクレーブ処理された堆肥の各ビーカーと、目に見えるプロキシプレートとして機能するNGMプレートに追加します。 ワームを添加する前に、ミクロコズムとプロキシプレートを20〜25°Cで24時間インキュベートします。 3.堆肥の小宇宙でワームを育てる 500〜1000個の卵またはL1幼虫3 を各小宇宙とプロキシプレートに追加し(ステップ2.7)、実験を開始します(図1D)。注:ここで説明する実験では、N2野生型ワームを利用します。しかしながら、他の C.エレガンス 株(および潜在的に他の線虫)を使用することができる。 ワームを20°C(通常は3日間)で成体になるまで上げます。 図1:堆肥の小宇宙の準備、ワームの飼育、収穫 。 (A)地元の土壌または堆肥を農産物で豊かにし、2週間インキュベートします。(B)オートクレーブ滅菌された濃縮土壌と(C)微生物抽出物を組み合わせ、(D)少なくとも24時間インキュベートしてから、同期したL1ワームを小宇宙に追加して実験を開始します。(E, F)収穫の準備ができたら、小宇宙からの堆肥をベアマン漏斗サポートシリンダーに加え、M9で覆います。(g)15分後、ろ液を50mLチューブに放出する。略称:sup. = 上清。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4.ワームを収穫するためのベアマン漏斗の準備 プラスチック製の漏斗の端に5〜8 cmの硬質ゴムチューブを取り付けて、Baermann漏斗を組み立てます。 クランプをチューブにスライドさせ、クランプで閉じます。 漏斗に、長さ7 cm、直径5 cmの円筒形のPVCパイプを置き、その底に1 mmのナイロンメッシュを接着します(図1E)。シリンダーに2枚のティッシュペーパーを並べます。 ベアマン漏斗をフラスコに入れます(図1F)。 5.小宇宙からワームを収穫し、それぞれの土壌サンプルを収集する ワームが飼育された小宇宙に20mLのM9を加え、混合物を攪拌してから、ビーカーからBaermann漏斗セットアップのティッシュペーパーで裏打ちされたシリンダーに混合物を注ぎます。M9を追加して、堆肥を漏斗に完全に沈めます。注: C.エレガンス (N2)の個体群は、 大腸菌を播種した標準的な寒天プレートと同様の速度で堆肥の小宇宙で成体に達します。特定の発生段階でワームを収集する際のさらなる精度については、ステップ3.3のプロキシプレートを参照してください。 30分後、クランプを外して、収穫したワームを含むろ液を50 mLチューブに放出します(図1G)。 シリンダーにM9を追加し、2回目のラウンドを繰り返してさらにワームを収穫し、追加のワームが必要な場合はもう一度繰り返します。注意: 収穫ラウンドを繰り返すときは、土壌粒子が通過する可能性のあるティッシュペーパーの完全性を損なわないように注意してください。最大4回の収穫ラウンドで、ティッシュペーパーの完全性を損なうことなく、小宇宙に最初に追加されたワームの少なくとも50%を分離する必要があります。 560 × g で2分間遠心分離してワームを濃縮します(RT)。血清学的ピペットで35 mLの上清を除去します。 残りの15 mLを15 mLチューブに移し、560 × g で1分間遠心分離して、ワームをさらに濃縮します。血清学的ピペットで上清14 mLを除去します。 並行して、残りの小宇宙土壌1 gを1.5 mLチューブに集めます。環境細菌群集を含む土壌サンプルを直ちに処理するか、後で核酸を抽出するために-20°Cで保存します(ワームサンプルの場合、以下で説明します)。 6.収穫されたワームの洗浄と表面滅菌 濃縮、採取したワーム1 mLをステップ5.5からガラスピペットを使用して1.5 mLチューブに移します。ワームがチューブの底に落ち着くように2分間インキュベートします。上清を除去し、下部100 μLを乱さないようにします。 1.5 mLのM9 + T(M9では0.025%Triton-X)で6回洗浄し、ワームが毎回底に定着するようにします。 洗浄したワームを100 μLの容量で、ガラスピペットを使用して新しい1.5 mLチューブに移します。注意: プロトコルのこの時点で、最初の洗浄から約30分が経過しているはずです(ステップ6.2)。レバミゾールを添加する前に少なくとも1時間、ワームを食物なしで放置することは、一過性の細菌の排泄および食物細菌の完全な消化を可能にするために推奨される。 100 μLの25 mMレバミゾール塩酸塩を加えて、ワームを麻痺させます。RTで5分間インキュベートします。 200 μLの4%漂白剤溶液を追加します。2分間インキュベートします。 最下段の150 μLを乱さずに上清を取り除き、上記のようにM9+Tで3回洗浄します。注意: サンプルの汚染を最小限に抑えるために、フィルター付きのM9 + T(0.2 μmフィルターを介して)を使用し、この時点から手袋を着用することをお勧めします。 洗浄後、最後の洗浄から残りの150 μLのうち50 μLを採取し、LBプレート上にプレートし、25°Cで48時間インキュベートして、外部細菌の効果的な除去を確認しました。注:最後の洗浄で最大30のコロニー(サンプルに残っている合計60の外部細菌細胞を表す)を観察することは許可されており、各成虫に典型的にコロニーを形成する数千の細菌を考えると、分析された微生物叢組成へのわずかな寄与しか持たないことが期待されます15。それ以上が観察されると、サンプルの完全性が損なわれる可能性があります。 表面滅菌したワームを直ちに使用するか(例えば、培養用の生菌を抽出するため[CFUカウント])、またはその後の核酸抽出のために-20°Cで保存してください。 7.DNA抽出 注:次の手順では、土壌から微生物DNAを抽出するために設計された市販のキット( 材料の表を参照)を使用して、収穫されたワームのDNA抽出について説明し、ワームからの微生物DNAの抽出を容易にするために以下に説明する変更を加えます。 表面滅菌ワームを含むサンプルをキット付属のチューブに移し(必要に応じてRTで解凍)、付属のガラスビーズを直径約30〜50 1 mmのジルコニアビーズと交換します(材料の表を参照)。注:観察されたDNA収量は、キットに付属のガラスビーズよりもジルコニアビーズの方が高くなります。この観察の背後にある理由は不明ですが、ジルコニアビーズは線虫のキューティクルをより効率的に壊し、より多くの細菌を放出する可能性があります。 堆肥サンプルの場合は、ガラスビーズを交換せずに、収集した土壌を約250mgをキットのチューブに追加します。 キットから提供された緩衝液をすべてのサンプルに加えた後、RTのパワーホモジナイザー( 材料表を参照)で2,000 rpmをそれぞれ30秒間2ラウンドホモジナイズし、その間に30秒間一時停止します。 キットのプロトコルに従って残りのDNA精製手順を完了します。ワームサンプルを50 μL以下の溶出バッファーで溶出し、シーケンシングに十分なDNA濃度を確保します。