İn Vitro Substrat Taraması için Saflaştırılmış Rekombinant Drosophila Caspases Kullanarak Bölünme Testleri

1. Bakterilerde rekombinant kaspaz ekspresyonu İlgilenilen geni (Kaspaz veya varsayılan substrat) standart protokolleri kullanarak N- ve / veya C-terminal etiketleri ile bir bakteri ekspresyon vektörüne klonlayın23.NOT: Etiketler rekombinant proteinlerin çözünürlüğünü artırabilir ve rekombinant proteinlerin saflaştırılması için kullanılır. Burada, Dronc, Drice ve katalitik mutantları, N-terminal 6xHis etiketi sağlayan pET28a vektörüne klonlanır (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (primer bilgi için Ek Tablo 1’e bakınız). İlgilenilen genlere sahip vektörleri, standart prosedürleri kullanarak yetkin BL21 (DE3) pLysS E. coli hücrelerine dönüştürün23,24. Transformasyon karışımını LB agar plakaları üzerine uygun antibiyotik (pET28a durumunda kanamisin) ile plakalayın ve dönüştürülmüş bakterileri seçin. (Ek Tablo 2’ye bakınız.) Plakadan bir koloni seçin ve sallanan bir platformda 220 rpm’de 37 ° C’de gece boyunca büyümek için uygun antibiyotik içeren 5 mL LB ortamında aşılayın. Ertesi gün, antibiyotik ile 30-50 mL (örnek başına) LB ortamı hazırlayın ve bir gecede yetiştirilen kültürün 1 mL’sini ekleyin. Bir biyofotometre / spektrofotometre kullanılarak 600 nm’deki (OD600) optik yoğunluk 0,1 ile 0,2 arasında olmalıdır. OD600 0,6’ya ulaşana kadar kültürü sallanan bir platformda 220 rpm’de 37 °C’de büyütün. OD600’ü 0,6’ya ulaşana kadar saatte bir kontrol edin. Bu yaklaşık 2 ila 3 saat sürer. Protein (kaspaz) ekspresyonunu indüklemek için, IPTG’yi 0.1-0.2 mM’lik bir nihai konsantrasyona ekleyin (IPTG stokundan 1:1.000-1:500 seyreltin, Ek Tablo 2’ye bakınız). Kültürleri 220 rpm’de 30 °C’de 3 saat boyunca büyütün.NOT: Zaman ve sıcaklık, ne tür bir proteinin ifade edildiğine ve çözünürlüğüne bağlıdır. Farklı kaspaz veya substratlar ifade edilirse bu koşulların ayarlanması gerekebilir. 3 saat sonra, kültürleri 50 mL santrifüj tüplerinde 20 dakika boyunca 4 ° C’de 2.000 x g’de döndürün. Süpernatantı atın ve pelet ile devam edin.NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve daha sonra devam ettirilebilir. Bakteriyel peletler -80 °C’de dondurulabilir. 2. Küçük ölçekli rekombinant kaspazların ekstraksiyonu Pelet edilmiş kültürlerle donmuş tüpleri -80 °C depodan çıkarın ve peleti yumuşatmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. 10 dakika sonra, yeni eklenen proteaz inhibitörleri, 10 mg / mL lizozim ve 50 U / mL benzonaz ile desteklenmiş 0.6 mL bakteriyel hücre lizis tamponu (Ek Tablo 2), 1 mL serolojik pipetli bir pipet kontrolörü kullanarak pelet içeren tüplere ekleyin. Aynı pipet ucuyla, herhangi bir pelet partikülü olmadan berrak soluk sarı bir çözelti görünene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti çözün. Buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Lizatı uygun santrifüj tüplerine aktarın ve lizatları 4 ° C’de 40 dakika boyunca 17.000 x g’de santrifüj edin. Süpernatantları 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, kaspazları içeren ham ekstrakttır. Tüpleri buz üzerinde tutun ve Ni-NTA agarozu ile saflaştırmaya devam edin. 3. Küçük ölçekli His etiketli kaspazların saflaştırılması Adım 2.5’ten itibaren kaspaz ekstraktlarının her bir tüpüne Ni-NTA agaroz bulamacının 0.2 mL’sini ekleyin. Tüpleri uçtan uca bir rotatörde 4 °C’de 1 saat boyunca döndürün. 1 saat sonra, Ni-NTA agarozu ile ekstraktı, ucu bozulmamış, bir rafa yerleştirilmiş 1 mL polipropilen sütunlara ekleyin. 5 dakika bekletin. 5 dakika sonra, sütunların kapağını çıkarın ve süpernatantın yerçekimi akışıyla dışarı akmasına izin verin. Ni-NTA agarozun paketlenmiş reçinesini bozmadan sütunlara 1 mL yıkama tamponunu (Ek Tablo 2) dikkatlice ekleyin ve yerçekimi akışıyla yıkayın. Yıkama adımını üç kez uygulayın. Kaspazların elüsyonu için, yıkama tamponunun tamamen boşaltılmasından sonra kolonların toplama nozulunun altına 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Her kolona 0,5 mL elüsyon tamponu ekleyin (kullanımdan hemen önce 1x proteaz inhibitörleri ile desteklenir) ve elüatı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.NOT: İnce saflaştırılmış elüat renkli olarak şeffaf olacaktır. Elüatları buz üzerinde tutun ve Bradford testi25 ile proteinlerin konsantrasyonunu ölçün. SDS-PAGE ile saflaştırılmış kaspazların saflığını/homojenliğini onaylayın ve ardından Coomassie Blue boyama26.NOT: 50 mL’lik bir LB kültürünün verimi 0.5 ila 1.5 mg kaspaz proteini arasında değişmektedir. Elüsyon için 0.5 mL elüsyon tamponunun kullanıldığı göz önüne alındığında, konsantrasyon 1 ila 3 mg / mL arasında değişmektedir. Saflaştırılmış kaspaz elüatlarının in vitro bölünme tahlilleri için aynı lizis ve saflaştırma gününde kullanılması önemlidir, çünkü bu kaspaz preparatları gece boyunca aktivitesini kaybeder. 4. Hücresiz ekspresyon sistemlerinde varsayılan kaspaz substratının ekspresyonu NOT: Bu protokolde, Dronc’un doğal substratı olan Drice, hem E. coli’deki rekombinant ekspresyon (yukarıdaki bölüm 3’e bakınız) hem de bir memeli hücresinden arındırılmış ekspresyon sistemi olan tavşan retikülosit lizatındaki (RRL) ekspresyon ile hazırlanır (bu bölüm, aşağıya bakınız). Varsayılan substratın genini, standart prosedürler23 kullanarak T7, T3 veya SP6 promotörü içeren bir ekspresyon vektörüne klonlayın.NOT: Bu protokolde, DriceC211A model substrat olarak kullanılmaktadır ve gen ekspresyonu için bir T7 promotörü taşıyan ve varsayılan protein substratını immünoblotlama yoluyla tespit için bir N-terminal Myc-etiketi ile etiketleyen pT7CFE1-N-Myc vektörüne klonlanmıştır. RRL’de, aday substratlar radyoaktif veya radyoaktif olmayan olarak sentezlenebilir.Radyoaktif olmayan sentez: 0.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 25 μL RRL, 2 μL reaksiyon tamponu, 0.5 μL Amino Asit Karışımı -Eksi Lösin (1 mM), 0.5 μL Amino Asit Karışımı-Eksi Metiyonin (1 mM), 1 μL Ribonükleaz İnhibitörü (40 U / μL), 2 μL DNA Şablonu (0.5 μg / μL) ve 1 μL T7-RNA Polimeraz ekleyin. Reaksiyonun son hacmini 50 μL’ye ayarlamak için nükleaz içermeyen su ekleyin.NOT: RRL lizat, endojen proteinlerin 100-200 mg / mL’sini içerir. İn vitro translasyon reaksiyonları için, RRL’yi konsantrasyonda ekleyin (burada 25 μL/50 μL reaksiyon). Radyoaktif sentez: 0.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 25 μL RRL lizat, 2 μL reaksiyon tamponu, 0.5 μL Amino Asit Karışımı-Eksi Metiyonin (1 mM), 1 μL Ribonükleaz İnhibitörü (40 U / μL), 2 μL DNA Şablonu (0.5 μg / μL), 2 μL S35 etiketli Metiyonin (10 mCi / mL’de 1000 Ci / mmol) ve 1 μL T7-RNA Polimeraz ekleyin. Reaksiyonun son hacmini 50 μL’ye ayarlamak için nükleaz içermeyen su ekleyin. Uçları ve tüpleri radyoaktif bir atık kabına atın.NOT: Amino Asit Karışımını Lösinsiz eklemeyin. pT7CFE1 vektörü, protein ekspresyonu için bir T7 promotörü kullanır. Diğer vektörler T3 veya SP6 destekleyicilerini kullanır. Bu durumda, T7 RNA polimeraz yerine T3 veya SP6 RNA polimerazlar kullanılmalıdır. Lütfen DNA kalıbının yüksek saflıkta olduğundan emin olun. Reaksiyonu 30 °C’de 90 dakika boyunca inkübe edin. 10 saniye boyunca kısaca döndürün ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. RRL’deki varsayılan substratın ekspresyon seviyesini SDS-PAGE ve immünoblotlama/otoradyografi ile kontrol edin.NOT: Bölünme reaksiyonuna eklenen RRL ekstraktı miktarı, tespit yöntemiyle (immünoblotlama veya S35 otoradyografi) tespit edilebilen protein miktarına dayanmalıdır. İn vitro bölünme testine (bir sonraki bölüm) devam edin veya -80 ° C’de saklayın. 5. RRL ile üretilen substratlarla in vitro bölünme testi Bölüm 4’te açıklandığı gibi oluşturulan varsayılan substratları ele alalım. Bu protokolde, model substrat olarak N-Myc-DriceC211A kullanılır. Varsayılan substratın ekspresyon seviyesine bağlı olarak (immünoblot veya otoradyografi analizi ile ayrı ayrı belirlenecek, bkz. adım 4.4), bölünme tahlilinde ilgilenilen protein ile programlanmış RRL’nin 1-10 μL’sini kullanın. Bölüm 1, 2 ve 3’te üretilen 10 μg saflaştırılmış kaspaz proteini ekleyin. Toplam reaksiyon hacmini kapaz tahlil tamponu ile 50 μL’ye getirin. Bir su banyosundaki reaksiyonları 3 saat boyunca 30 ° C’de inkübe edin. Bölünme testine uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun. Burada kontrol olarak katalitik mutant DroncC318A kullanılmaktadır. 3 saat sonra, tüpleri buz üzerine aktararak reaksiyonları durdurun. 50 mM DTT içeren bir birim LDS örnek arabelleği ekleyin. LDS numune tamponunun eklenmesiyle reaksiyon tamamen durdurulur. Numuneleri 75 °C’de bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Hızlı bir şekilde döndürün, hafifçe karıştırın, numune başına 24 μL yükleyin ve SDS-PAGE’i çalıştırın (bkz. bölüm 7) veya numuneleri -20 °C’de saklayın. 6. Bakteriyel olarak eksprese edilen rekombinant substrat proteini ile in vitro bölünme testi 0,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 μg saflaştırılmış aday substrat (burada 6xHis-DriceC211A, bölüm 1, 2 ve 3’te üretilen) ekleyin. Bölüm 1 ve 2’de üretilen saflaştırılmış kaspaz proteinlerinin 10 μg’ını ekleyin. Kaspaz tahlil tamponu kullanarak toplam hacmi 50 μL’ye getirin. 5,5 ile 5,9 arasındaki adımları izleyin. 7. SDS-PAGE ve immünoblotlama Bölünme reaksiyonlarını (24 μL) %4- Tris-Glisin veya Bis-Tris gradyan jellerine (Malzeme Tablosu) yükleyin ve standart prosedürleri kullanarak sonuçları görselleştirmek için protein elektroforezi ve immünoblotlama (veya S35 etiketli substratlar kullanılıyorsa otoradyografi) yapın27,28.NOT: Burada, bu protokolde, tampon ve LDS yükleme tamponu çalıştıran paspaslı Bis-Tris gradyan jelleri kullanılmıştır. Genel olarak, Tris-Glisin jellerinin yaygın olarak kullanılan PAGE protokolleri, Tris-Glisin-SDS çalışan tampon kullanılarak çalışır ve SDS yükleme tamponu iyi çalışır.