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Bioengineering

In vitro Ensayos de escisión utilizando Caspasas de Drosophila recombinantes purificadas para cribado de sustrato

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/64392
,
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology,UMass Chan Medical School

Summary

Aquí presentamos un protocolo para expresar y purificar las caspasas recombinantes de Drosophila Dronc y Drice, y su uso en ensayos de escisión in vitro .

Abstract

Las caspasas son proteasas de muerte celular muy específicas que están involucradas en procesos apoptóticos y no apoptóticos. Si bien el papel de las caspasas durante la apoptosis ha sido muy bien definido y se han identificado y caracterizado muchos sustratos proteolíticos apoptóticos de las caspasas, el papel de las caspasas para los procesos no apoptóticos no se comprende bien. En particular, hasta ahora se han identificado pocos sustratos no apoptóticos de caspasas. Aquí, con el fin de facilitar la identificación y caracterización de sustratos potenciales de caspasas, se describe un protocolo que permite el ensayo de sustratos candidatos en ensayos de escisión de caspasa in vitro . Este protocolo incluye la producción y purificación de proteínas caspasa recombinantes, la producción de los sustratos candidatos ya sea recombinantemente o en un sistema de expresión libre de células, y la reacción de escisión in vitro real seguida de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Este protocolo está diseñado para las caspasas Dronc y Drice de Drosophila , pero se puede adaptar fácilmente para caspasas de otros organismos, incluidos los mamíferos.

Introduction

La muerte celular programada o apoptosis se ejecuta mediante una clase de proteasas de muerte celular altamente especializadas denominadas caspasas (revisadas en la referencia1). Las caspasas son proteasas de Cys que contienen un residuo de Cys en el sitio catalítico. Han definido sitios de escisión de consenso y escinden sustratos proteolíticamente después de residuos de Asp (aunque también se ha informado que la Dronc caspasa Dronc se escinde después de los residuos de Glu2). Se subdividen en caspasas iniciadoras (también conocidas como pasasas apicales o aguas arriba) y efectoras (verdugo o aguas abajo). Las caspasas del iniciador activan las caspasas efectoras. Por ejemplo, en mamíferos, la caspasa iniciadora Caspasa-9 escinde y activa la caspasa efectora Caspasa-33. Asimismo, en Drosophila melanogaster, la caspasa-9-ortóloga Dronc escinde y activa la caspasa-3-ortología Drice 2,4. Durante la apoptosis, las caspasas efectoras escinden cientos de sustratos que conducen a la muerte de la célula5.

Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas (zimógenos) en la célula. En esta forma, contienen un prodominio N-terminal, una subunidad grande con el Cys catalítico en la porción central de la proenzima, y una pequeña subunidad en el C-terminal 1 (Figura 1). El mecanismo de activación es diferente entre las caspasas iniciadoras y efectoras. Las caspasas iniciadoras (Caspasa-9, Dronc) requieren dimerización para su activación, que ocurre por incorporación a un gran complejo proteico, denominado apoptosoma6. Para la incorporación al apoptosoma, Caspasa-9 y Dronc llevan un dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD) en el prodominio N-terminal (Figura 1). El componente apoptosómico Apaf-1 también contiene un CARD y recluta Caspasa-9 o Dronc a través de la interacción CARD/CARD en el apoptosoma 3,6,7. Mientras que la Caspasa-9 y Dronc pueden ser procesadas proteolíticamente en el apoptosoma, este procesamiento no es totalmente necesario para la actividad enzimática 8,9.

En contraste, las caspasas efectoras (Caspasa-3, Drice) no llevan una CARD en sus prodominios y no se incorporan a grandes complejos proteicos para la activación1. Dependen de la escisión proteolítica por Caspasa-9 activa o Dronc1, respectivamente. La caspasa efectora activa forma un tetrámero compuesto de dos subunidades grandes y dos pequeñas, y por lo tanto contiene dos sitios catalíticos (Figura 1). Es importante destacar para este protocolo, la expresión recombinante de caspasas en E. coli causa el autoprocesamiento y la activación de caspasas, incluyendo Drice 10 y Dronc 2,8,9,11,12, incluso en ausencia de Apaf-1. Este autoprocesamiento permite realizar ensayos de escisión in vitro de sustratos candidatos con proteína caspasa recombinante.

Las caspasas no solo están involucradas en la apoptosis, sino que también pueden tener muchas funciones no apoptóticas, incluyendo proliferación, diferenciación, migración celular, poda neuronal, inmunidad innata y otras13,14,15. Actualmente se desconoce cómo las células pueden sobrevivir a pesar de contener caspasas activas durante procesos no apoptóticos. Es posible que estas células activen caspasas sólo a niveles subletales16 o secuestren caspasas activas en compartimentos no apoptóticos de la célula como la membrana plasmática17,18. Por lo tanto, la identificación y verificación de sustratos no apoptóticos no solo revelará cómo las caspasas median procesos no apoptóticos, sino que también puede ayudar a comprender cómo las células pueden sobrevivir en presencia de caspasas activas.

Las proteínas candidatas como sustratos de caspasa se pueden identificar utilizando métodos genéticos y bioquímicos. Las proteínas identificadas se pueden verificar para detectar la presencia de los sitios de escisión de Dronc de consenso. Esto se puede hacer inspeccionando visualmente la secuencia de proteínas o utilizando herramientas bioinformáticas en línea más sofisticadas como CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Estas herramientas utilizan los sitios de escisión de consenso conocidos de las caspasas y las consideraciones estructurales para predecir nuevos objetivos de caspasas. Si bien CasCleave incorpora la información de sustratos verificados de Caspasas-1, -3, -6, -7 y -8 humanas, también puede ser útil para los fines descritos aquí, ya que estas caspasas y sus sitios de escisión de consenso están bien conservados. Sin embargo, debido a que el sitio de escisión de Dronc no está bien definido (dos estudios identificaron dos sitios de escisión óptimos diferentes, TATD/E2 y LALD9), los sustratos candidatos también se examinan para detectar la presencia de otro sitio de escisión de caspasas, incluido Drice.

Para validar los sustratos predichos de las caspasas, se necesitan ensayos adicionales. Uno de estos ensayos es la demostración de que una caspasa dada puede realmente escindir la proteína candidata in vitro. Aquí, proporcionamos un protocolo conveniente para los ensayos de escisión de caspasa in vitro . Usando este protocolo, los sustratos candidatos se prueban con Dronc como caspasa. También se pueden probar como sustratos de Drice. Aunque este protocolo está escrito para las Caspasas Dronc y Drice de Drosophila , también se puede adaptar para caspasas de otros organismos.

La extracción y purificación de Dronc y Drice junto con el ensayo de escisión in vitro debe realizarse el mismo día debido a la pérdida de actividad catalítica por estas caspasas. Este protocolo ha sido modificado y optimizado a partir de publicaciones anteriores 8,9,11,12,21,22. En este protocolo, cuatro proteínas caspasa diferentes se expresan recombinantemente en la cepa BL21 (DE3) pLysS de E. coli. Estas proteínas son: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt y 6xHis-DriceC211A. Cada una de estas proteínas se marca con 6 residuos de histidina (6xHis) en el extremo N para su purificación. Dronc wt y Dricewt son las proteínas de tipo salvaje y pueden autoprocesarse en la caspasa activa tras la expresión recombinante. DroncC318A y DriceC211A codifican formas mutantes de Dronc y Drice que cambian el residuo catalítico de Cys a un residuo de Ala. Estas construcciones son catalíticamente inactivas y no se pueden procesar automáticamente (consulte la Figura 2A). Se utilizan como controles en el ensayo de escisión. Debido a que DriceC211A no puede autoprocesarse, también se utiliza como sustrato modelo para Droncwt en el ensayo de escisión in vitro descrito aquí.

Protocol

1. Expresión de caspasa recombinante en bacterias Clonar el gen de interés (Caspasa o sustrato putativo) en un vector de expresión bacteriana con etiqueta(s) N- y/o C-terminal(es) utilizando protocolos estándar23.NOTA: Las etiquetas pueden aumentar la solubilidad de las proteínas recombinantes y se utilizan para la purificación de las proteínas recombinantes. Aquí, Dronc, Drice y sus mutantes catalíticos se clonan en el vector pET28a, que proporciona una etiqueta N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (para obtener información sobre la cartilla, véase el cuadro complementario 1). Transformar los vectores con los genes de interés en células competentes de BL21 (DE3) pLysS E. coli utilizando procedimientos estándar23,24. Colocar en placa la mezcla de transformación en placas de agar LB con el antibiótico apropiado (kanamicina en caso de pET28a) para seleccionar las bacterias transformadas. (Véase el cuadro complementario 2.) Recoger una colonia de la placa e inocular en 5 ml de medio LB que contenga el antibiótico apropiado para crecer durante la noche a 37 °C a 220 rpm en una plataforma de agitación. Al día siguiente, prepare 30-50 ml (por muestra) de medio LB con antibiótico y agregue 1 ml del cultivo cultivado durante la noche. La densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un biofotómetro/espectrofotómetro debe estar entre 0,1 y 0,2. Cultivar a 37 °C a 220 rpm en una plataforma de agitación hasta que OD600 alcance 0,6. Compruebe el OD600 cada hora hasta que llegue a 0,6. Esto toma alrededor de 2 a 3 h. Para inducir la expresión de proteínas (caspasa), añadir IPTG a una concentración final de 0,1-0,2 mM (diluir 1:1.000-1:500 de la cepa de IPTG, véase la Tabla suplementaria 2). Cultivar los cultivos durante 3 h a 30 °C a 220 rpm.NOTA: El tiempo y la temperatura dependen del tipo de proteína que se expresa y de su solubilidad. Estas condiciones pueden necesitar ser ajustadas si se expresan diferentes caspasas o sustratos. Después de 3 h, centrifugar los cultivos en tubos de centrífuga de 50 ml durante 20 min a 4 °C a 2.000 x g. Deseche el sobrenadante y proceda con el pellet.NOTA: El protocolo se puede detener en este punto y continuar más tarde. Los pellets bacterianos se pueden congelar a -80 °C. 2. Extracción de caspasas recombinantes a pequeña escala Retire los tubos congelados con los cultivos granulados de almacenamiento a -80 °C y manténgalos en hielo durante 10 minutos para ablandar el pellet. Después de 10 min, añadir 0,6 ml de tampón de lisis celular bacteriana (Tabla complementaria 2) suplementado con inhibidores de la proteasa recién añadidos, 10 mg/ml de lisozima y 50 U/ml de benzonasa en los tubos que contienen pellets utilizando un controlador de pipetas con una pipeta serológica de 1 ml. Con la misma punta de pipeta, disolver el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que se vea una solución transparente de color amarillo pálido sin partículas de pellets. Incubar durante 30 min en hielo. Transfiera el lisado a tubos de centrífuga apropiados y centrifugar los lisados a 17.000 x g durante 40 min a 4 °C. Transfiera los sobrenadantes a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Este es el extracto crudo que contiene las caspasas. Mantenga los tubos en hielo y proceda a la purificación con agarosa Ni-NTA. 3. Purificación de caspasas marcadas con His-tagged a pequeña escala Agregue 0.2 ml de la suspensión al 50% de agarosa Ni-NTA a cada tubo de extractos de caspasa del paso 2.5. Gire los tubos en un rotador de extremo a extremo durante 1 h a 4 °C. Después de 1 h, agregue el extracto con la agarosa Ni-NTA a columnas de polipropileno de 1 ml con la punta intacta, colocadas en una rejilla. Dejar reposar durante 5 min. Después de 5 minutos, retire la tapa de las columnas y deje que el sobrenadante fluya por gravedad. Agregue cuidadosamente 1 ml del tampón de lavado (Tabla suplementaria 2) a las columnas sin alterar la resina empaquetada de agarosa Ni-NTA y lávela a través del flujo por gravedad. Realice el paso de lavado tres veces. Para la elución de las caspasas, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 ml debajo de la boquilla colectora de las columnas después del drenaje completo del tampón de lavado. Agregue 0,5 ml del tampón de elución (suplementado con 1x inhibidores de la proteasa inmediatamente antes de su uso) a cada columna y recoja el eluyido en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.NOTA: El eluido purificado fino será de color transparente. Mantener los eluatos en hielo y medir la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford25. Confirmar la pureza/homogeneidad de las caspasas purificadas mediante SDS-PAGE seguido de la tinción Coomassie Blue26.NOTA: El rendimiento de un cultivo de 50 ml LB oscila entre 0,5 y 1,5 mg de proteína caspasa. Dado que se utilizan 0,5 ml de tampón de elución para la elución, la concentración varía de 1 a 3 mg/ml. Es importante utilizar los eluidos de caspasa purificados para ensayos de escisión in vitro el mismo día de lisis y purificación, ya que estas preparaciones de caspasa pierden actividad durante la noche. 4. Expresión del sustrato de caspasa putativo en sistemas de expresión libre de células NOTA: En este protocolo, Drice, el sustrato natural de Dronc, se prepara tanto por expresión recombinante en E. coli (ver sección 3 anterior) como por expresión en lisado de reticulocitos de conejo (RRL), un sistema de expresión libre de células de mamíferos (esta sección, ver más abajo). Clone el gen del sustrato putativo en un vector de expresión que contenga un promotor T7, T3 o SP6 utilizando procedimientos estándar23.NOTA: En este protocolo, DriceC211A se está utilizando como sustrato modelo y se clonó en el vector pT7CFE1-N-Myc, que lleva un promotor T7 para la expresión génica y marca el sustrato de proteína putativo con una etiqueta Myc N-terminal para su detección por immunoblotting. En RRL, los sustratos candidatos pueden sintetizarse radiactivamente o no radiactivamente.Síntesis no radiactiva: En un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, añadir 25 μL de RRL, 2 μL de tampón de reacción, 0,5 μL de mezcla de aminoácidos -menos leucina (1 mM), 0,5 μL de mezcla de aminoácidos-menos metionina (1 mM), 1 μL de inhibidor de ribonucleasa (40 U/μL), 2 μL de plantilla de ADN (0,5 μg/μL) y 1 μL de T7-ARN polimerasa. Añadir agua libre de nucleasas para ajustar el volumen final de la reacción a 50 μL. Mezclar suavemente los componentes pipeteando o agitando con la punta de la pipeta, y girar hacia abajo brevemente.NOTA: El lisado RRL contiene 100-200 mg/mL de las proteínas endógenas. Para reacciones de traducción in vitro , añadir el RRL a una concentración del 50% (aquí reacción de 25 μL/50 μL). Síntesis radiactiva: En un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, añadir 25 μL de lisado RRL, 2 μL de tampón de reacción, 0,5 μL de mezcla de aminoácidos-menos metionina (1 mM), 1 μL de inhibidor de ribonucleasa (40 U/μL), 2 μL de plantilla de ADN (0,5 μg/μL), 2 μL de metionina marcada con S35 (1000 Ci/mmol a 10 mCi/mL) y 1 μL de T7-ARN polimerasa. Añadir agua libre de nucleasas para ajustar el volumen final de la reacción a 50 μL. Mezclar suavemente los componentes pipeteando o agitando con la punta de la pipeta, y girar hacia abajo brevemente. Deseche las puntas y los tubos en un contenedor de residuos radiactivos.NOTA: No agregue la mezcla de aminoácidos sin leucina. El vector pT7CFE1 utiliza un promotor T7 para la expresión de proteínas. Otros vectores utilizan promotores T3 o SP6. En ese caso, se deben usar ARN polimerasas T3 o SP6 en lugar de ARN polimerasa T7. Asegúrese de que la plantilla de ADN sea de alta pureza. Incubar la reacción a 30 °C durante 90 min. Gire brevemente durante 10 s y coloque los tubos sobre hielo. Comprobar el nivel de expresión del sustrato putativo en RRL mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia/autorradiografía.NOTA: La cantidad de extracto de RRL añadido a la reacción de escisión debe basarse en la cantidad de proteína que puede detectarse mediante el método de detección (ya sea inmunotransferencia o autorradiografía S35 ). Proceder al ensayo de escisión in vitro (siguiente sección) o almacenarlo a -80 °C. 5. Ensayo de escisión in vitro con sustratos generados con RRL Tome el(los) sustrato(s) putativo(s) generado(s), como se describe en la sección 4. En este protocolo, N-Myc-DriceC211A se utiliza como sustrato modelo. Dependiendo del nivel de expresión del sustrato putativo (que se determinará por separado mediante inmunoblot o análisis de autorradiografía, ver paso 4.4), utilizar 1-10 μL de la RRL programada con la proteína de interés en el ensayo de escisión. Añadir 10 μg de proteína caspasa purificada generada en las secciones 1, 2 y 3. Llevar el volumen total de reacción a 50 μL con tampón de ensayo de caspasa. Incubar las reacciones en un baño maría a 30 °C durante 3 h. Asegúrese de incluir los controles apropiados en el ensayo de escisión. Aquí, el mutante catalítico DroncC318A se utiliza como control. Después de 3 h, detenga las reacciones transfiriendo los tubos sobre hielo. Agregue un volumen de búfer de muestra LDS que contenga 50 mM de TDT. La reacción se detiene por completo con la adición de un tampón de muestra LDS. Incubar las muestras a 75 °C en un bloque de calor durante 10 min. Girar rápidamente, mezclar con movimiento, cargar 24 μL por muestra y ejecutar la SDS-PAGE (ver sección 7) o almacenar las muestras a -20 °C. 6. Ensayo de escisión in vitro con proteína sustrato recombinante expresada bacterianamente Agregue 10 μg de sustrato candidato purificado (aquí 6xHis-DriceC211A, generado en las secciones 1, 2 y 3) a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Añadir 10 μg de las proteínas de caspasa purificadas generadas en las secciones 1 y 2. Llevar el volumen total a 50 μL mediante el uso de tampón de ensayo de caspasas. Siga los pasos 5.5 a 5.9. 7. SDS-PAGE e immunoblotting Cargar las reacciones de escisión (24 μL) en geles de gradiente de Tris-glicina o Bis-Tris al 4%-12% (Tabla de materiales) y realizar electroforesis de proteínas e inmunotransferencia (o autorradiografía si se utilizan sustratos marcados con S35) para visualizar los resultados utilizando procedimientos estándar27,28.NOTA: Aquí, en este protocolo, se utilizaron geles degradados Bis-Tris con búfer de ejecución de Mops y búfer de carga LDS. En general, los protocolos PAGE comúnmente utilizados de los geles Tris-Glycine se ejecutan utilizando el búfer de ejecución Tris-Glycine-SDS y el búfer de carga SDS funcionan bien.

Representative Results

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la inducción de proteínas caspasas en E. coli, la purificación de las caspasas recombinantes de Drosophila Dronc y Drice, la síntesis de sustratos candidatos y la reacción de escisión in vitro con sustratos candidatos (aquí DriceC211A) y la caspasa Dronc. El mutante catalítico DriceC211A se utilizó como sustrato modelo en este ensayo porque no tiene actividad de autoprocesamiento (Figura 2A) y permanece de longitud completa hasta que es escindido por Droncwt. DriceC211A siempre debe usarse como un control positivo para validar que la preparación de Droncwt tiene actividad enzimática. La Figura 2A proporciona un ejemplo representativo de la expresión y purificación de caspasas recombinantes. Se indujeron y purificaron cuatro caspasas recombinantes diferentes: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt y 6xHis-DriceC211A. Las caspasas purificadas fueron manejadas por SDS-PAGE, inmunobloted, y el blot fue sondeado con un anticuerpo anti-His (diluido 1:5,000; seguido de IgG anti-ratón, anticuerpo ligado a HRP (1:10,000)). El 6xHis-Dronc (proDronc) sin procesar funciona a un peso molecular relativo (MW r) de 55 kDa (carril 2) y el 6xHis-Drice sin procesar (proDrice) tiene un MWr de 35 kDa (carril 4). El autoprocesamiento de las caspasas es visible por la aparición de bandas de MW r máspequeñas que, debido a la presencia de la etiqueta His, en el extremo N, representan las grandes subunidades de las caspasas (Figura 1). En el caso de 6x-Dronc, la subunidad grande tiene un MWr de 40 kDa (carril 1). La subunidad grande de 6x-Drice corre a 23 kDa (carril 3). Los mutantes catalíticos 6xHis-DroncC318A y 6xHis-DriceC211A no se autoprocesan y solo son detectables como proteínas de longitud completa (carriles 2 y 4). Figura 2B Para demostrar que la preparación de 6xHis-Droncwt producida y purificada bacterialmente tiene actividad enzimática, se realizó un ensayo de escisión in vitro como se describe en este protocolo. Como control negativo, se utilizó el mutante catalítico 6xHis-DroncC318A. El sustrato fue N-Myc-DriceC211A generado por RRL, que está marcado con una etiqueta Myc en el extremo N. Después de la reacción de escisión in vitro, las proteínas se separaron por SDS-PAGE, inmunoblot y los blots se incubaron con un anticuerpo anti-Myc (diluido 1:1.000) seguido de anti-ratón IgG, anticuerpo unido a HRP (1:10.000)) para detectar N-Myc-DriceC211A. La escisión exitosa y, por lo tanto, la actividad enzimática de la caspasa se pueden demostrar por la aparición de al menos una banda de MWr más pequeña en comparación con la forma completa y sin procesar del sustrato. El N-Myc-Drice C211A sin procesar y de longitud completa tiene un MWr de 40 kDa (carriles 2 y 4), mientras que la subunidad grande de N-Myc-DriceC211A procesada funciona a 30 kDa (carril 3). El carril 1 representa el lisado RRL no programado (sin plásmido/transcripción añadida). Lane 2 demuestra la producción in vitro de DriceC211A por expresión RRL. El carril 3 contiene la reacción de escisión in vitro con 6xHis-Droncwt. Lane 4 contiene la reacción de escisión in vitro con 6xHis-DroncC318A. Figura 2C Se analizó mediante SDS-PAGE e immunoblot una reacción de escisión in vitro que utiliza caspasa recombinante y purificada (6xHis-Droncwt y 6x-His-DroncC318A) y sustrato (6xHis-DriceC211A) según este protocolo. Para el análisis de la reacción de escisión, se utilizó en este inmunoblot el anticuerpo anti-didura de Drice (diluido 1:5.000; seguido de IgG anti-conejo, anticuerpo ligado a HRP (1:10.000)). El anticuerpo Drice anti-escisión detecta su neo-epítopo en la subunidad grande (23 kDa) de 6xHis-DriceC211A sólo después de su procesamiento por 6xHis-Droncwt (carril 1). El mutante catalítico 6xHis-DroncC318A no puede procesar 6xHis-Drice C211A en este ensayo y el 6xHis-DriceC211A de longitud completa aparece como una banda débil sin procesar de 35 kDa (carril 2). Figura 1: Estructura de dominio de las caspasas iniciadoras Caspasa-9 y Dronc y caspasas efectoras Caspasa-3 y Drice. CARD – dominio de activación y reclutamiento de caspasas; Cys – ubicación relativa del residuo catalítico de cisteína; L – subunidad grande; S – subunidad pequeña. Se indica la ubicación de los prodominios N-terminal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Resultados representativos . (A) Análisis de inmunoblot de preparaciones recombinantes purificadas de 6xHis-Dronc y 6xHis-Drice, probadas con un anticuerpo anti-His. Sin procesar (proDronc y proDrice) y 6xHis-Dric, 6xHis-Drice y 6xHis-Drice escindidos se indican con flechas. Los marcadores MW están indicados a la izquierda. (B) Análisis de inmunoblot de la reacción de escisión in vitro de N-Myc-Drice generada por RRL con caspasas 6xHis-Droncwt (carril 3) o 6x-His-DroncC318A (carril 4) probadas con un anticuerpo anti-Myc. Las reacciones RRL no programadas y programadas (N-Myc-DriceC211A) se cargan y separan en los carriles 1 y 2. Sin procesar (proDrice) y N-Myc-Drice escindido se indican con flechas. Los marcadores MW están indicados a la izquierda. (C) Análisis de inmunoblot de la reacción de escisión in vitro de 6xHis-DriceC211A recombinante expresada y purificada bacterianamente con caspasas 6xHis-Droncwt (carril 1) o 6x-His-DroncC318A (carril 2), probadas con un anticuerpo Drice anti-hendido. Longitud completa (proDrice) y 6xHis-DriceC211A escindido se indican con flechas. Los marcadores MW están indicados a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cuadro complementario 1: Esta tabla contiene cebadores utilizados para la clonación en el vector pET28a. Haga clic aquí para descargar este archivo. Cuadro complementario 2: Esta tabla contiene la composición de búferes y medios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La mayor parte de nuestro conocimiento sobre las caspasas y la función de la caspasa se ha derivado de un intenso trabajo en apoptosis durante las últimas tres décadas. Está muy bien establecido que las caspasas del iniciador procesan proteolíticamente las caspasas efectoras, y cientos de proteínas han sido identificadas como sustratos de caspasas efectoras durante la apoptosis 5,29. En contraste, se sabe mucho menos sobre la función de las caspasas para procesos no apoptóticos y qué sustratos no apoptóticos están procesando. Es concebible que las caspasas iniciadoras sean tomadores de decisiones clave aquí. Durante la apoptosis, activan las caspasas efectoras que causan la muerte celular. Sin embargo, para desencadenar procesos no apoptóticos, pueden activar diferentes proteínas (distintas de las caspasas efectoras), que controlan el proceso no apoptótico. Este protocolo prueba proteínas candidatas como sustratos de la caspasa iniciadora Dronc en Drosophila 17,30.

Los sustratos que se probarán en el ensayo de escisión pueden producirse en un sistema de expresión libre de células de mamífero in vitro , como RRL, o mediante expresión recombinante en E. coli. Hay varias ventajas para la expresión in vitro utilizando RRL sobre la expresión bacteriana. El protocolo de expresión RRL es simple y rápido, permitiendo preparar muchos sustratos diferentes en paralelo. En muchos casos, el extracto de RRL que contiene la proteína de interés puede almacenarse a -80 °C antes de su uso en el ensayo de escisión (aunque esto debe determinarse por separado para cada sustrato). El sustrato putativo se puede etiquetar con S35-Met, lo que permite un fácil análisis por autorradiografía después de SDS-PAGE. Eso es particularmente útil, si no hay anticuerpos específicos de sustrato disponibles. Alternativamente, si no se desea el etiquetado S35-Met, el sustrato putativo se puede etiquetar con etiquetas comunes como etiquetas Flag, HA o Myc, lo que permite la detección de la escisión de la caspasa por immunoblotting.

Es necesario enfatizar fuertemente que el éxito de este protocolo depende de la purificación cuidadosa y consistente de las proteínas Dronc y Drice recombinantes. Desafortunadamente, estas proteínas no se pueden almacenar, ni siquiera a corto plazo, ni en el refrigerador ni congeladas. Pierden la actividad enzimática durante la noche en cualquier forma almacenada. Por lo tanto, deben prepararse recién el día del ensayo de escisión. Independientemente de la(s) proteína(s) candidata(s) que se esté probando, DriceC211A siempre debe utilizarse como control positivo para validar la actividad enzimática del preparado de Droncwt (ver Figura 2B,C). Alternativamente, la actividad de las preparaciones de Dronc y Drice también puede probarse mediante escisión in vitro de sustratos de tetrapéptidos sintéticos fluorogénicos 2,9,31.

Si se utilizan anticuerpos para detectar los sustratos candidatos, deben ser validados por el usuario32,33. Eso también se aplica a los anticuerpos disponibles comercialmente que detectan etiquetas de epítopos como Flag, HA, Myc u otros. La mala calidad de los anticuerpos puede oscurecer resultados importantes. También se recomienda el marcado de doble epítopo de los sustratos candidatos en los extremos N y C con diferentes etiquetas34. Si se produce una escisión, el doble marcado ayuda a rastrear ambos productos de escisión y puede ayudar a dilucidar si la escisión se produce en uno o más sitios.

Si bien este protocolo valida fácilmente el sustrato biológico conocido de Dronc, Drice, también existen limitaciones. Una limitación es que se trata de un protocolo in vitro con proteínas recombinantes. En estos ensayos, las caspasas están presentes en una concentración no fisiológicamente alta, lo que es evidente a partir de la observación de que pueden autoprocesarse espontáneamente en E. coli. El autoprocesamiento espontáneo generalmente no ocurre bajo las condiciones fisiológicas. Esta alta concentración de caspasa puede causar actividad espuria que resulta en falsos positivos. Los falsos positivos pueden eliminarse reduciendo la concentración de caspasa en la reacción de escisión in vitro . Además, como se describe con más detalle a continuación, se necesitan ensayos adicionales para confirmar sustratos genuinos y eliminar falsos positivos.

Las caspasas recombinantes pueden no tener la misma especificidad que tienen en su entorno celular normal in vivo. Por ejemplo, la actividad de las caspasas puede ser modificada por modificaciones post-traduccionales. Estos no están presentes en las proteínas recombinantes. Además, in vivo, las caspasas iniciadoras, incluido Dronc, se incorporan a grandes complejos de proteínas como el apoptosoma. Bajo las condiciones de este protocolo, no se logra la formación del apoptosoma. Eso requeriría la expresión recombinante de Drosophila Apaf-1 (también conocida como Dark o Hac-1)35-37 que tiene sus propios desafíos. Por lo tanto, in vitro, Dronc puede no tener la misma especificidad que tiene in vivo.

También es concebible que Dronc se incorpore a un complejo proteico diferente para procesos no apoptóticos. Esto puede conferir una especificidad de escisión diferente a Dronc, lo que también podría explicar por qué Dronc no induce la apoptosis en condiciones no apoptóticas. En relación con esto, CasCleave utiliza los sitios de consenso de escisión conocidos para predecir nuevos sustratos de caspasa. Sin embargo, se desconoce si los mismos sitios de consenso de escisión también se utilizan para procesos no apoptóticos. De hecho, recientemente, se demostró que la Caspasa-3 cambia su sitio de consenso preferido durante un proceso no apoptótico en el tronco cerebral auditivo en desarrollo en el embrión de pollo38. Del mismo modo, si las caspasas iniciadoras se incorporan en diferentes complejos de proteínas, pueden tener una especificidad diferente y, por lo tanto, pueden escindirse en diferentes secuencias de consenso.

Estas limitaciones ilustran que no basta con basarse únicamente en los ensayos de escisión in vitro descritos en este protocolo. Se deben emplear enfoques alternativos para validar aún más los resultados obtenidos utilizando este protocolo. Idealmente, los ensayos in vivo deben usarse para abordar las siguientes preguntas: ¿La proteína candidata se procesa proteolíticamente durante el proceso no apoptótico in vivo? Si es así, ¿se utiliza el mismo sitio de escisión in vivo e in vitro? ¿Cuál es la consecuencia si la escisión está bloqueada por la mutagénesis del sitio de escisión? ¿El procesamiento del sustrato candidato depende de las caspasas, y si es así, cuál? ¿Cuál es el papel de los fragmentos de escisión para el proceso no apoptótico? Estas preguntas pueden abordarse fácilmente en los organismos modelo genéticos como C. elegans y Drosophila utilizando métodos genéticos y transgénicos estándar.

En resumen, este protocolo describe un método confiable y consistente para producir caspasas enzimáticamente activas, específicamente las Caspasas Dronc y Drice de Drosophila . El objetivo final de este protocolo es examinar si Dronc puede escindir sustratos candidatos in vitro, que fueron identificados por enfoques genéticos, bioquímicos o bioinformáticos. Como se explicó en el párrafo anterior, se requieren ensayos adicionales para validar estas proteínas como sustratos de caspasa in vivo. Dado el grado de conservación de los genes de caspasa a través de metazoos, debería ser posible adaptar este protocolo también a caspasas de otros organismos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a la Dra. Elif Kamber-Kaya por su ayuda para establecer el protocolo en el laboratorio. El Dr. Guy Salvesen amablemente proporcionó el mutante DriceC211A 9. Este trabajo fue financiado por un premio MIRA del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de subvención 2R35GM118330. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001
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References

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Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).
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