インビトロ 基質スクリーニングのための精製組換え ショウジョウバエ カスパーゼを用いた切断アッセイ

1. 細菌における組換えカスパーゼ発現 標準プロトコル23を使用して、目的の遺伝子(カスパーゼまたは推定基質)をN末端および/またはC末端タグを持つ細菌発現ベクターにクローニングします。注:タグは組換えタンパク質の溶解度を高めることができ、組換えタンパク質の精製に使用されます。ここで、Dronc、Drice、およびそれらの触媒変異体はベクターpET28aにクローニングされ、N末端6xHisタグ(pET28a-6xHis-Dronc wt、pET28a-6xHis-Dronc C318A、pET28a-6xHis-Dricewt、pET28a-6xHis-Drice C211A)を提供する。(プライマー情報については、補足表1を参照してください)。 標準的な手順23,24を用いて、目的の遺伝子を有するベクターをコンピテントBL21(DE3)pLysS 大腸菌細胞に形質転換する。形質転換混合物を適切な抗生物質(pET28aの場合はカナマイシン)を含むLB寒天プレートにプレートして、形質転換細菌を選択します。(別表2参照) プレートからコロニーを選び、適切な抗生物質を含む5 mLのLB培地に接種して、振とうプラットフォーム上で37°C、220 rpmで一晩増殖させます。 翌日、抗生物質を含むLB培地30〜50 mL(サンプルあたり)を調製し、一晩培養した培養液1 mLを追加します。バイオフォトメーター/分光光度計を使用した600nm(OD600)での光学密度は、0.1〜0.2である必要があります。 OD600 が0.6に達するまで、振とうプラットフォーム上で37°C、220rpmで培養物を成長させます。OD600 が0.6に達するまで、毎時ODを確認します。これには約2〜3時間かかります。 タンパク質(カスパーゼ)の発現を誘導するには、IPTGを最終濃度0.1〜0.2 mMまで添加します(IPTGストックから1:1,000〜1:500に希釈、 補足表2を参照)。 培養物を30°C、220rpmで3時間培養します。注:時間と温度は、発現しているタンパク質の種類とその溶解度によって異なります。異なるカスパーゼまたは基質が発現する場合は、これらの条件を調整する必要があります。 3時間後、培養液を50 mL遠沈管で2,000 x g、4°Cで20分間スピンダウンします。上清を捨ててペレットを進めます。メモ: プロトコルはこの時点で停止し、後で続行できます。細菌ペレットは-80°Cで凍結することができる。 2.小規模組換えカスパーゼ抽出 ペレット培養物を含む凍結チューブを-80°Cの保存から取り出し、氷上で10分間保持してペレットを柔らかくします。 10分後、1 mLの血清学的ピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤、10 mg/mLのリゾチームおよび50 U/mLのベンゾナーゼを添加した0.6 mLの細菌細胞溶解バッファー(補足表2)をペレット含有チューブに加えます。 同じピペットチップで、ペレット粒子のない透明な淡黄色の溶液が見えるまで上下にピペッティングしてペレットを溶解します。氷上で30分間インキュベートします。 ライセートを適切な遠心チューブに移し、ライセートを17,000 x g で4°Cで40分間遠心分離します。 上清を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。これはカスパーゼを含む粗抽出物です。 チューブを氷上に保ち、Ni-NTAアガロースで精製を進めます。 3. 小規模Hisタグカスパーゼ精製 Ni-NTAアガロースの50%スラリーを、ステップ2.5からのカスパーゼ抽出物の各チューブに0.2 mL加えます。エンドオンエンドローテーター上でチューブを4°Cで1時間回転させます。 1時間後、Ni-NTAアガロースを含む抽出物を、先端をそのままにして1 mLのポリプロピレンカラムに加え、ラックに入れます。5分間放置します。 5分後、カラムのキャップを外し、上澄み液を重力流で流出させます。 Ni-NTAアガロースの充填樹脂を乱さずに1 mLの洗浄バッファー(補足表2)をカラムに注意深く加え、重力流で洗浄します。 洗浄ステップを3回実行します。 カスパーゼを溶出するには、洗浄バッファーを完全に排出した後、1.5 mLの微量遠心チューブをカラムの収集ノズルの下に置きます。 0.5 mLの溶出バッファー(使用直前に1xプロテアーゼ阻害剤を補充)を各カラムに加え、1.5 mLの微量遠心チューブに溶出液を回収します。注:細かく精製された溶出液は透明になります。 溶出液を氷上に保ち、Bradfordアッセイ25によってタンパク質の濃度を測定します。精製されたカスパーゼの純度/均質性をSDS-PAGEとそれに続くクーマシーブルー染色26で確認する。注:50 mL LB培養の収量は、0.5〜1.5 mgのカスパーゼタンパク質の範囲です。溶出には0.5 mLの溶出バッファーを使用すると、濃度は1〜3 mg/mLの範囲になります。精製されたカスパーゼ溶出物は、溶解および精製の同じ日に in vitro 切断アッセイに使用することが重要です。 4. 無細胞発現系における推定カスパーゼ基質の発現 注:このプロトコルでは、Droncの天然基質であるDriceは、 大腸菌 での組換え発現(上記のセクション3を参照)と、哺乳類の無細胞発現システムであるウサギ網状赤血球ライセート(RRL)での発現の両方によって調製されます(このセクション、以下を参照)。 標準的な手順23を用いて、推定基質の遺伝子をT7、T3、またはSP6プロモーターのいずれかを含む発現ベクターにクローニングする。注:このプロトコルでは、DriceC211A がモデル基質として使用されており、遺伝子発現用のT7プロモーターを搭載し、イムノブロッティングによる検出のために推定タンパク質基質にN末端Mycタグでタグ付けするベクターpT7CFE1-N-Mycにクローニングされました。 RRLでは、候補基質は放射性または非放射性のいずれかで合成することができる。非放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRL、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスロイシン(1 mM)、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを追加します。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。注:RRLライセートには、100〜200 mg / mLの内因性タンパク質が含まれています。 インビトロ 翻訳反応の場合は、RRLを50%濃度で添加します(ここでは25 μL/50 μL反応)。 放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRLライセート、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、2 μLのS35標識メチオニン(10 mCi/mLで1000 Ci/mmol)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。チップとチューブは放射性廃棄物容器に廃棄してください。注意: ロイシンなしでアミノ酸混合物を追加しないでください。pT7CFE1ベクターは、タンパク質発現にT7プロモーターを使用します。他のベクターはT3またはSP6プロモーターを使用する。その場合、T7 RNAポリメラーゼの代わりにT3またはSP6 RNAポリメラーゼを使用する必要があります。DNAテンプレートが高純度であることを確認してください。 反応液を30°Cで90分間インキュベートします。 10秒間短時間回転させ、チューブを氷の上に置きます。RRL中の推定基質の発現レベルをSDS-PAGEおよびイムノブロッティング/オートラジオグラフィーで確認してください。注:切断反応に添加されるRRL抽出物の量は、検出方法(イムノブロッティングまたはS35 オートラジオグラフィーのいずれか)で検出できるタンパク質の量に基づいている必要があります。 in vitro 切断アッセイ(次のセクション)に進むか、-80°Cで保存してください。 5. RRLで生成された基質を用いた in vitro 切断アッセイ セクション4で説明されているように、生成された推定基板を取ります。このプロトコルでは、N-Myc-DriceC211A がモデル基板として使用されます。 推定基質の発現レベルに応じて(イムノブロットまたはオートラジオグラフィー分析によって個別に決定される、ステップ4.4を参照)、切断アッセイにおいて目的のタンパク質でプログラムされた1〜10μLのRRLを使用する。 セクション1、2、および3で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg追加します。 カスパーゼアッセイバッファーで総反応量を50 μLにします。 反応物を30°Cの水浴中で3時間インキュベートします。切断アッセイに適切なコントロールを含めるようにしてください。ここでは、触媒変異体DroncC318A を対照として用いる。 3時間後、チューブを氷上に移して反応を停止します。 50 mM DTTを含むLDSサンプルバッファーを1容量加えます。LDSサンプルバッファーを添加して反応を完全に停止させます。 サンプルを75°Cのヒートブロックで10分間インキュベートします。 素早くスピンし、フリックして混合し、サンプルあたり24 μLをロードし、SDS-PAGE(セクション7を参照)を実行するか、サンプルを-20°Cで保存します。 6.細菌発現組換え基質タンパク質を用いた in vitro 切断アッセイ 10 μgの精製候補基質(ここではセクション1、2、および3で生成した6xHis-DriceC211A)を0.5 mLマイクロ遠心チューブに追加します。 セクション1および2で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg添加します。カスパーゼアッセイバッファーを使用して、総容量を50 μLにします。 手順 5.5 から 5.9 に従います。 7. SDS-PAGEとイムノブロッティング 切断反応(24 μL)を4%-12%トリス-グリシンまたはビス-トリスグラジエントゲル(材料表)にロードし、タンパク質電気泳動およびイムノブロッティング(またはS35標識基質を使用する場合はオートラジオグラフィー)を実行して、標準的な手順27,28を使用して結果を視覚化します。注:ここでは、このプロトコルでは、MopsランニングバッファーとLDSローディングバッファーを含むBis-Trisグラジエントゲルを使用しました。一般に、トリス-グリシンゲルの一般的に使用されるPAGEプロトコルは、トリス-グリシン-SDSランニングバッファーとSDSローディングバッファーを使用して実行されます。