במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

1. ביטוי קספאז רקומביננטי בחיידקים שכפלו את הגן המעניין (Caspase או substrate putative) לווקטור ביטוי חיידקי עם תגי N- ו/או C-terminal באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים23.הערה: תגים יכולים להגדיל את המסיסות של החלבונים הרקומביננטיים ומשמשים לטיהור החלבונים הרקומביננטיים. כאן, Dronc, Drice, והמוטציות הקטליטיות שלהם משוכפלות לתוך הווקטור pET28a, המספק תג N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (למידע ראשוני ראו טבלה משלימה 1). הפוך את הווקטורים עם הגנים המעניינים לתאי BL21 (DE3) pLysS E. coli מוסמכים באמצעות נהלים סטנדרטיים23,24. צלחת את תערובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה (kanamycin במקרה של pET28a) כדי לבחור חיידקים מותמרים. (עיין בטבלה משלימה 2.) בחרו מושבה מהצלחת וחסנו ב-5 מ”ל של מדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-220 סל”ד על פלטפורמת טלטול. למחרת, הכינו 30-50 מ”ל (לכל דגימה) של מדיום LB עם אנטיביוטיקה והוסיפו 1 מ”ל מהתרבית שגדלה בן לילה. הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) באמצעות ביו-פוטומטר/ספקטרופוטומטר צריכה להיות בין 0.1 ל-0.2. הגדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-220 סל”ד על פלטפורמת רעידות עד ש-OD600 יגיע ל-0.6. בדוק את OD600 כל שעה עד שהוא מגיע 0.6. זה לוקח בערך 2 עד 3 שעות. כדי לגרום לביטוי חלבון (caspase), הוסף IPTG לריכוז סופי של 0.1-0.2 mM (יש לדלל 1:1,000-1:500 ממלאי IPTG, ראה טבלה משלימה 2). הגדל את התרביות במשך 3 שעות ב-30°C ב-220 סל”ד.הערה: הזמן והטמפרטורה תלויים בסוג החלבון המתבטא ובמסיסותו. ייתכן שיהיה צורך להתאים תנאים אלה אם באים לידי ביטוי קספאזות או מצעים שונים. לאחר 3 שעות, סובב את התרביות בצינורות צנטריפוגה של 50 מ”ל למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-2,000 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט והמשיכו עם הכדור.הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולהמשיך מאוחר יותר. כדוריות חיידקים ניתן להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. 2. מיצוי קספאזות רקומביננטיות בקנה מידה קטן הסר את הצינורות הקפואים עם תרביות הכדורים מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ושמור אותם על קרח למשך 10 דקות כדי לרכך את הכדור. לאחר 10 דקות, הוסיפו 0.6 מ”ל של חיץ תזה של תאי חיידקים (טבלה משלימה 2) בתוספת מעכבי פרוטאז טריים שנוספו, 10 מ”ג/מ”ל של ליזוזים ו-50 U/mL של בנזונאז לתוך הצינורות המכילים גלולות באמצעות בקר פיפטה עם פיפטה סרולוגית של 1 מ”ל. בעזרת אותו קצה פיפטה, ממיסים את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שנראית תמיסה צלולה-צהובה-בהירה ללא חלקיקי גלולה. דגירה במשך 30 דקות על קרח. מעבירים את הליזאט לצינורות צנטריפוגה מתאימים ואת הצנטריפוגה בליזאטים ב-17,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל. זוהי התמצית הגולמית המכילה את הקספאזות. שמור את הצינורות על הקרח והמשך לטיהור עם Ni-NTA agarose. 3. טיהור קספאזות מתויגות בקנה מידה קטן הוסיפו 0.2 מ”ל מתוך 50% ה-50% של אגרוז Ni-NTA לכל שפופרת של תמציות הקספאז משלב 2.5. סובב את הצינורות על סיבוב מקצה לקצה במשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר 1 שעות, להוסיף את התמצית עם Ni-NTA agarose ל 1 מ”ל פוליפרופילן עמודים עם קצה שלם, ממוקם במתלה. תן לזה לעמוד במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, הסר את מכסה העמודים ותן לסופר-נאטנט לזרום החוצה על ידי זרימת כוח הכבידה. הוסיפו בזהירות 1 מ”ל ממאגר הכביסה (טבלה משלימה 2) לעמודים מבלי להפריע לשרף הארוז הארוז של Ni-NTA ושטפו אותו בזרימת הכבידה. בצעו את שלב הכביסה שלוש פעמים. עבור elution של caspases, למקם 1.5 מ”ל צינורות microcentrifuge מתחת לזרבובית איסוף של העמודים לאחר ניקוז מלא של חיץ לשטוף. יש להוסיף 0.5 מ”ל של חיץ האלוציה (בתוספת מעכבי פרוטאז 1x מיד לפני השימוש) לכל עמודה ולאסוף את האלואט בצינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל.הערה: הצבע המטוהר העדין יהיה שקוף. שמור את האלואטים על הקרח ומדוד את ריכוז החלבונים על ידי מבחן ברדפורד25. אשר טוהר/הומוגניות של הקספאזות המטוהרות על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם כחול של Coomassie26.הערה: התפוקה של תרבית LB של 50 מ”ל נעה בין 0.5 ל-1.5 מ”ג של חלבון קספאז. בהתחשב בכך 0.5 מ”ל של חיץ elution משמש elution, הריכוז נע בין 1 ל 3 מ”ג / מ”ל. חשוב להשתמש ב-caspase המטוהר eluates עבור מבחני ביקוע במבחנה באותו יום של תזה וטיהור, שכן תכשירי קספאזה אלה מאבדים פעילות במהלך הלילה. 4. ביטוי של מצע הקספאזה הפוטטיבי במערכות ביטוי נטולות תאים הערה: בפרוטוקול זה, Drice, המצע הטבעי של Dronc, מוכן הן על ידי ביטוי רקומביננטי ב- E. coli (ראה סעיף 3 לעיל) והן על ידי ביטוי ב- reticulocyte lysate ארנב (RRL), מערכת ביטוי ללא תאים של יונקים (סעיף זה, ראה להלן). שכפלו את הגן של המצע הפוטטיבי לווקטור ביטוי המכיל מקדם T7, T3 או SP6 באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות23.הערה: בפרוטוקול זה, DriceC211A משמש כמצע המודל ושוכפל לווקטור pT7CFE1-N-Myc, הנושא מקדם T7 לביטוי גנים ומתייג את מצע החלבון הפוטטיבי עם תג Myc מסוף N לזיהוי על ידי אימונובלוטציה. ב- RRL, מצעים מועמדים יכולים להיות מסונתזים באופן רדיואקטיבי או לא רדיואקטיבי.סינתזה לא רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ”ל, הוסף 25 μL של RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו – מינוס לאוצין (1 mM), 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו – מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U / μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 מיקרוגרם / μL), ו 1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה.הערה: ליזאט RRL מכיל 100-200 מ”ג/מ”ל של החלבונים האנדוגניים. לתגובות תרגום חוץ-גופי , הוסף את ה-RRL בריכוז של 50% (כאן תגובת 25 μL/50 μL). סינתזה רדיואקטיבית: בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ”ל, הוסף 25 μL של ליזאט RRL, 2 μL של מאגר תגובה, 0.5 μL של תערובת חומצות אמינו-מינוס מתיונין (1 mM), 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U/μL), 2 μL של תבנית DNA (0.5 μg/μL), 2 μL של S35 שכותרתו מתיונין (1000 Ci/mmol ב-10 mCi/mL) ו-1 μL של T7-RNA פולימראז. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הסופי של התגובה ל-50 μL. ערבבו בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג או ערבוב עם קצה הפיפטה, וסובבו מעט כלפי מטה. יש להשליך טיפים וצינורות במיכל פסולת רדיואקטיבי.הערה: אין להוסיף את תערובת חומצות האמינו ללא לאוצין. וקטור pT7CFE1 משתמש במקדם T7 לביטוי חלבונים. וקטורים אחרים משתמשים במקדמי T3 או SP6. במקרה כזה, יש להשתמש בפולימראזות T3 או SP6 RNA במקום T7 RNA פולימראז. אנא וודאו שתבנית הדנ”א היא בעלת טוהר גבוה. לדגור את התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. סובבו לזמן קצר במשך 10 שניות והניחו את הצינורות על קרח. בדוק את רמת הביטוי של המצע הפוטטיבי ב- RRL על ידי SDS-PAGE ואימונובלוטינג / אוטורדיוגרפיה.הערה: כמות תמצית RRL שנוספה לתגובת המחשוף צריכה להתבסס על כמות החלבון שניתן לזהות בשיטת הגילוי (או אימונובלוטינג או אוטורדיוגרפיה S35 ). המשך לבדיקת המחשוף במבחנה (הקטע הבא) או אחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. 5. בדיקת מחשוף במבחנה עם מצעים שנוצרו עם RRL קח את המצע(ים) הפוטטיביים שנוצרו, כמתואר בסעיף 4. בפרוטוקול זה, N-Myc-DriceC211A משמש כמצע מודל. בהתאם לרמת הביטוי של המצע הפוטטיבי (שייקבע בנפרד על ידי ניתוח אימונובלוט או אוטורדיוגרפיה, ראה שלב 4.4), השתמש ב- 1-10 μL של RRL המתוכנת עם החלבון המעניין בבדיקת המחשוף. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבון קספאז מטוהר שנוצר בסעיפים 1, 2 ו-3. הבא את נפח התגובה הכולל ל-50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז. לדגור את התגובות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הקפד לכלול את הפקדים המתאימים בבדיקת המחשוף. כאן, המוטציה הקטליטית DroncC318A משמשת כבקרה. לאחר 3 שעות, להפסיק את התגובות על ידי העברת צינורות על קרח. הוסף אמצעי אחסון אחד של מאגר דגימת LDS המכיל DTT של 50 mM. התגובה נעצרת לחלוטין עם תוספת של מאגר מדגם LDS. דגירה של הדגימות ב-75 מעלות צלזיוס בבלוק חום למשך 10 דקות. סובב במהירות, ערבב על ידי הבהוב, טען 24 μL לכל דגימה והפעל את ה- SDS-PAGE (ראה סעיף 7) או אחסן את הדגימות ב- -20 °C. 6. בדיקת מחשוף במבחנה עם חלבון מצע רקומביננטי המתבטא באופן חיידקי הוסף 10 מיקרוגרם של מצע מועמד מטוהר (כאן 6xHis-DriceC211A, שנוצר בסעיפים 1, 2 ו -3) לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ”ל. הוסיפו 10 מיקרוגרם של חלבוני הקספאז המטוהרים שנוצרו בסעיפים 1 ו-2. הבא את הנפח הכולל ל- 50 μL באמצעות מאגר בדיקת קספאז. בצע את שלבים 5.5 עד 5.9. 7. SDS-PAGE ואימונובלוטינג טען את תגובות המחשוף (24 μL) על 4%-12% טריס-גליצין או ביס-טריס ג’ל הדרגתי (טבלת חומרים) ובצע אלקטרופורזה של חלבונים ואימונובלוטינג (או אוטורדיוגרפיה אם משתמשים במצעים בעלי תוויתS 35) כדי להמחיש את התוצאות באמצעות נהלים סטנדרטיים27,28.הערה: כאן, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בג’לים הדרגתיים של Bis-Tris עם מאגר פועל של Mops ומאגר טעינה של LDS. באופן כללי, פרוטוקולי PAGE הנפוצים של ג’ל Tris-Glycine פועלים באמצעות מאגר הריצה Tris-Glycine-SDS ומאגר טעינת ה-SDS פועלים היטב.