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Bioengineering

In vitro Spaltungstests mit gereinigten rekombinanten Drosophila-Caspasen für das Substrat-Screening

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/64392
,
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology,UMass Chan Medical School

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Drosophila caspases Dronc und Drice und deren Verwendung in In-vitro-Spaltungsassays .

Abstract

Caspasen sind sehr spezifische Zelltodproteasen, die an apoptotischen und nicht-apoptotischen Prozessen beteiligt sind. Während die Rolle von Caspasen während der Apoptose sehr gut definiert ist und viele apoptotische proteolytische Substrate von Caspasen identifiziert und charakterisiert wurden, ist die Rolle von Caspasen für nicht-apoptotische Prozesse nicht gut verstanden. Insbesondere wurden bisher nur wenige nicht-apoptotische Substrate von Caspasen identifiziert. Um die Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Caspase-Substrate zu erleichtern, wird hier ein Protokoll beschrieben, das die Prüfung von Kandidatensubstraten in Caspase-Spaltungsassays in vitro ermöglicht. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung und Reinigung von rekombinanten Caspase-Proteinen, die Herstellung der Kandidatensubstrate entweder rekombinant oder in einem zellfreien Expressionssystem und die eigentliche In-vitro-Spaltungsreaktion gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting. Dieses Protokoll ist auf die Drosophila caspases Dronc und Drice zugeschnitten, kann aber leicht an Caspasen anderer Organismen, einschließlich Säugetiere, angepasst werden.

Introduction

Der programmierte Zelltod oder die Apoptose wird durch eine Klasse hochspezialisierter Zelltodproteasen ausgeführt, die als Caspasen bezeichnet werden (überprüft in Referenz1). Caspasen sind Cys-Proteasen, die einen Cys-Rest in der katalytischen Stelle enthalten. Sie haben Konsensspaltstellen definiert und Substrate proteolytisch nach Asp-Resten gespalten (obwohl auch berichtet wurde, dass die Drosophila caspase Dronc nach Glu-Resten spaltet2). Sie werden in Initiator- (auch apikale oder stromaufwärts genannte) und Effektor-Caspasen (Henker oder nachgeschaltet) unterteilt. Initiator-Caspasen aktivieren Effektor-Caspasen. Bei Säugetieren spaltet und aktiviert der Initiator Caspase-9 beispielsweise den Effektor Caspase-33. Ebenso spaltet und aktiviert in Drosophila melanogaster die Caspase-9-ortholog Dronc die Caspase-3-ortholog Drice 2,4. Während der Apoptose spalten Effektor-Caspasen Hunderte von Substraten, was zum Tod der Zelle führt5.

Caspasen werden als inaktive Proenzyme (Zymogene) in der Zelle synthetisiert. In dieser Form enthalten sie eine N-terminale Prodomäne, eine große Untereinheit mit den katalytischen Cys im zentralen Teil des Proenzyms und eine kleine Untereinheit am C-Terminus 1 (Abbildung 1). Der Aktivierungsmechanismus unterscheidet sich zwischen Initiator- und Effektor-Caspasen. Initiator-Caspasen (Caspase-9, Dronc) benötigen eine Dimerisierung für die Aktivierung, die durch Einbau in einen großen Proteinkomplex erfolgt, der als Apoptosom6 bezeichnet wird. Für den Einbau in das Apoptosom tragen Caspase-9 und Dronc eine Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD) in der N-terminalen Prodomäne (Abbildung 1). Die Apoptosomenkomponente Apaf-1 enthält ebenfalls eine CARD und rekrutiert Caspase-9 oder Dronc über CARD/CARD-Interaktion in das Apoptosom 3,6,7. Während Caspase-9 und Dronc proteolytisch im Apoptosom verarbeitet werden können, ist diese Verarbeitung für die enzymatischeAktivität 8,9 nicht vollständig erforderlich.

Im Gegensatz dazu tragen Effektor-Caspasen (Caspase-3, Drice) keine CARD in ihren Prodomänen und werden nicht in große Proteinkomplexe zur Aktivierung1 eingebaut. Sie sind abhängig von proteolytischer Spaltung durch aktives Caspase-9 bzw. Dronc1. Der aktive Effektor Caspase bildet ein Tetramer, das aus zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten besteht und somit zwei katalytische Stellen enthält (Abbildung 1). Wichtig für dieses Protokoll ist, dass die rekombinante Expression von Caspasen in E. coli die Autoverarbeitung und Aktivierung von Caspasen, einschließlich Drice 10 und Dronc 2,8,9,11,12, auch in Abwesenheit von Apaf-1 verursacht. Diese Autoprozessierung ermöglicht die Durchführung von In-vitro-Spaltungsassays von Kandidatensubstraten mit rekombinantem Caspaseprotein.

Caspasen sind nicht nur an der Apoptose beteiligt, sondern können auch viele nicht-apoptotische Funktionen haben, einschließlich Proliferation, Differenzierung, Zellmigration, neuronales Beschneiden, angeborene Immunität und andere13,14,15. Derzeit ist nicht bekannt, wie Zellen trotz aktiver Caspasen bei nicht-apoptotischen Prozessen überleben können. Es ist möglich, dass diese Zellen Caspasen nur auf subletalen Ebenen16 aktivieren oder aktive Caspasen in nicht-apoptotischen Kompartimenten der Zelle wie der Plasmamembran17,18 sequestrieren. Daher wird die Identifizierung und Verifizierung von nicht-apoptotischen Substraten nicht nur zeigen, wie Caspasen nicht-apoptotische Prozesse vermitteln, sondern kann auch helfen zu verstehen, wie Zellen in Gegenwart aktiver Caspasen überleben können.

Kandidatenproteine als Caspase-Substrate können mit genetischen und biochemischen Methoden identifiziert werden. Identifizierte Proteine können auf das Vorhandensein der Konsensus-Dronc-Spaltstellen überprüft werden. Dies kann durch visuelle Inspektion der Proteinsequenz oder durch die Verwendung ausgefeilterer bioinformatischer Online-Tools wie CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20 erfolgen. Diese Werkzeuge verwenden die bekannten Konsensspaltstellen von Caspasen und strukturelle Überlegungen, um neue Ziele von Caspasen vorherzusagen. Während CasCleave die Informationen von verifizierten Substraten aus menschlichen Caspases-1, -3, -6, -7 und -8 enthält, kann es dennoch auch für die hier beschriebenen Zwecke nützlich sein, da diese Caspasen und ihre Konsensspaltstellen gut erhalten sind. Da die Dronc-Spaltstelle jedoch nicht gut definiert ist (zwei Studien identifizierten zwei verschiedene optimale Spaltstellen, TATD/E2 und LALD9), werden die Kandidatensubstrate auch auf das Vorhandensein anderer Caspase-Spaltstellen, einschließlich Drice, untersucht.

Um die vorhergesagten Substrate von Caspasen zu validieren, sind zusätzliche Assays notwendig. Einer dieser Assays ist der Nachweis, dass eine gegebene Caspase das Kandidatenprotein tatsächlich in vitro spalten kann. Hier bieten wir ein praktisches Protokoll für In-vitro-Caspase-Spaltungstests . Mit diesem Protokoll werden Kandidatensubstrate mit Dronc als Caspase getestet. Sie können auch als Substrate von Drice getestet werden. Obwohl dieses Protokoll für die Drosophila caspases Dronc und Drice geschrieben ist, kann es auch für Caspasen anderer Organismen angepasst werden.

Die Extraktion und Reinigung von Dronc und Drice zusammen mit dem In-vitro-Spaltungstest muss aufgrund des Verlusts der katalytischen Aktivität durch diese Caspasen am selben Tag durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde gegenüber früheren Veröffentlichungen 8,9,11,12,21,22 modifiziert und optimiert. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Caspase-Proteine rekombinant im E. coli-Stamm BL21 (DE3) pLysS exprimiert. Diese Proteine sind: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt und 6xHis-DriceC211A. Jedes dieser Proteine wird am N-Terminus zur Reinigung mit 6 Histidinresten (6xHis) markiert. Dronc wt und Dricewt sind die Wildtyp-Proteine und können bei rekombinanter Expression automatisch in die aktive Caspase umgewandelt werden. DroncC318A und DriceC211A kodieren mutierte Formen von Dronc und Drice, die den katalytischen Cys-Rest in einen Ala-Rest umwandeln. Diese Konstrukte sind katalytisch inaktiv und können nicht automatisch verarbeitet werden (siehe Abbildung 2A). Sie werden als Kontrollen im Spalttest verwendet. Da DriceC211A nicht autoprozessieren kann, wird es auch als Modellsubstrat für Droncwt in dem hier beschriebenen In-vitro-Spaltungsassay verwendet.

Protocol

1. Rekombinante Caspase-Expression in Bakterien Klonen Sie das interessierende Gen (Caspase oder mutmaßliches Substrat) in einen bakteriellen Expressionsvektor mit N- und/oder C-terminalen Tags unter Verwendung von Standardprotokollen23.HINWEIS: Tags können die Löslichkeit der rekombinanten Proteine erhöhen und werden zur Reinigung der rekombinanten Proteine verwendet. Hier werden Dronc, Drice und ihre katalytischen Mutanten in den Vektor pET28a geklont, der einen N-terminalen 6xHis-Tag liefert (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (Grundinformationen siehe Zusatztabelle 1). Die Vektoren mit den interessierenden Genen werden unter Verwendung der Standardverfahren 23,24 in kompetente BL21 (DE3) pLysS E. coli-Zellen umgewandelt. Die Transformationsmischung auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum (Kanamycin im Falle von pET28a) beschichten, um transformierte Bakterien auszuwählen. (Siehe Zusatztabelle 2.) Wählen Sie eine Kolonie von der Platte und inokulieren Sie in 5 ml LB-Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält, um über Nacht bei 37 ° C bei 220 U / min auf einer Schüttelplattform zu wachsen. Am nächsten Tag bereiten Sie 30-50 ml (pro Probe) LB-Medium mit Antibiotikum vor und fügen Sie 1 ml der über Nacht gewachsenen Kultur hinzu. Die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Biophotometer/Spektralphotometer sollte zwischen 0,1 und 0,2 liegen. Die Kultur wird bei 37 °C bei 220 U/min auf einer Schüttelplattform gezüchtet, bis OD600 0,6 erreicht. Überprüfen Sie den OD600 jede Stunde, bis er 0,6 erreicht. Dies dauert etwa 2 bis 3 Std. Um die Proteinexpression (Caspase) zu induzieren, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 0,1-0,2 mM hinzu (verdünnen Sie 1:1.000-1:500 aus IPTG-Brühe, siehe Zusatztabelle 2). Die Kulturen 3 h lang bei 30 °C bei 220 U/min wachsen lassen.HINWEIS: Zeit und Temperatur hängen davon ab, welche Art von Protein exprimiert wird und wie gut es löslich ist. Diese Bedingungen müssen möglicherweise angepasst werden, wenn verschiedene Caspasen oder Substrate exprimiert werden. Nach 3 h die Kulturen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 20 min bei 4 °C bei 2.000 x g herunterschleudern. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie mit dem Pellet fort.HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt und später fortgesetzt werden. Bakterienpellets können bei -80 °C eingefroren werden. 2. Extraktion rekombinanter Caspasen in kleinem Maßstab Entfernen Sie die gefrorenen Röhrchen mit den pelletierten Kulturen aus der Lagerung bei -80 °C und halten Sie sie 10 min auf Eis, um das Pellet weich zu machen. Nach 10 min werden 0,6 ml bakterieller Zelllysepuffer (Zusatztabelle 2), ergänzt mit frisch zugegebenen Proteaseinhibitoren, 10 mg/ml Lysozym und 50 U/ml Benzonase in die pellethaltigen Röhrchen gegeben, wobei ein Pipettencontroller mit einer 1 ml serologischen Pipette verwendet wird. Lösen Sie das Pellet mit derselben Pipettenspitze auf, indem Sie auf und ab pipettieren, bis eine klare hellgelbe Lösung ohne Pelletpartikel sichtbar ist. 30 min auf Eis inkubieren. Das Lysat in geeignete Zentrifugenröhrchen überführen und die Lysate bei 17.000 x g für 40 min bei 4 °C zentrifugieren. Die Überstände werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dies ist der Rohextrakt, der die Caspasen enthält. Halten Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Reinigung mit Ni-NTA-Agarose fort. 3. Reinigung von Caspasen mit His-Tags in kleinem Maßstab Zu jedem Röhrchen der Caspase-Extrakte aus Schritt 2.5 werden 0,2 ml der 50%igen Aufschlämmung Ni-NTA-Agarose hinzugefügt. Drehen Sie die Rohre auf einem End-on-End-Rotator für 1 h bei 4 °C. Nach 1 h wird der Extrakt mit der Ni-NTA-Agarose in 1 ml Polypropylensäulen gegeben, wobei die Spitze intakt ist und in ein Gestell gelegt wird. 5 min stehen lassen. Nach 5 min die Kappe der Säulen entfernen und den Überstand durch Schwerkraft ausfließen lassen. Man gibt vorsichtig 1 ml des Waschpuffers (Zusatztabelle 2) zu den Säulen, ohne das verpackte Harz der Ni-NTA-Agarose zu stören, und wäscht es durch die Schwerkraft. Führen Sie den Waschschritt dreimal durch. Zur Elution der Caspasen legen Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen nach vollständigem Entleeren des Waschpuffers unter die Auffangdüse der Säulen. Fügen Sie 0,5 ml des Elutionspuffers (ergänzt mit 1x Proteaseinhibitoren unmittelbar vor Gebrauch) zu jeder Säule hinzu und sammeln Sie das Eluat in den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.HINWEIS: Das fein gereinigte Eluat hat eine transparente Farbe. Halten Sie die Eluate auf Eis und messen Sie die Konzentration der Proteine mit Bradford Assay25. Bestätigen Sie die Reinheit/Homogenität der gereinigten Caspasen durch SDS-PAGE gefolgt von Coomassie Blue Färbung26.HINWEIS: Die Ausbeute einer 50-ml-LB-Kultur liegt zwischen 0,5 und 1,5 mg Caspase-Protein. Da 0,5 ml Elutionspuffer für die Elution verwendet werden, liegt die Konzentration zwischen 1 und 3 mg/ml. Es ist wichtig, die gereinigten Caspase-Eluate für In-vitro-Spaltungstests am selben Tag der Lyse und Reinigung zu verwenden, da diese Caspase-Präparate über Nacht an Aktivität verlieren. 4. Expression des mutmaßlichen Caspase-Substrats in zellfreien Expressionssystemen HINWEIS: In diesem Protokoll wird Drice, das natürliche Substrat von Dronc, sowohl durch rekombinante Expression in E. coli (siehe Abschnitt 3 oben) als auch durch Expression in Kaninchenretikulozytenlysat (RRL), einem zellfreien Expressionssystem für Säugetiere, hergestellt (dieser Abschnitt, siehe unten). Klonen des Gens des mutmaßlichen Substrats in einen Expressionsvektor, der entweder einen T7-, T3- oder SP6-Promotor enthält, unter Verwendung von Standardverfahren23.HINWEIS: In diesem Protokoll wird DriceC211A als Modellsubstrat verwendet und in den Vektor pT7CFE1-N-Myc kloniert, der einen T7-Promotor für die Genexpression trägt und das mutmaßliche Proteinsubstrat mit einem N-terminalen Myc-Tag zum Nachweis durch Immunoblotting markiert. In RRL können Kandidatensubstrate entweder radioaktiv oder nicht-radioaktiv synthetisiert werden.Nicht-radioaktive Synthese: In einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 25 μL RRL, 2 μL Reaktionspuffer, 0,5 μL Aminosäuregemisch – minus Leucin (1 mM), 0,5 μL Aminosäuregemisch – minus Methionin (1 mM), 1 μL Ribonuklease-Inhibitor (40 U / μL), 2 μL DNA-Template (0,5 μg / μL) und 1 μL T7-RNA-Polymerase hinzugefügt. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Endvolumen der Reaktion auf 50 μL einzustellen. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren oder Rühren mit der Pipettenspitze und drehen Sie kurz herunter.HINWEIS: Das RRL-Lysat enthält 100-200 mg/ml der endogenen Proteine. Für in vitro translationale Reaktionen wird die RRL in einer Konzentration von 50% zugegeben (hier 25 μL/50 μL Reaktion). Radioaktive Synthese: In einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 25 μL RRL-Lysat, 2 μL Reaktionspuffer, 0,5 μL Aminosäuregemisch minus Methionin (1 mM), 1 μL Ribonuklease-Inhibitor (40 U/μL), 2 μL DNA-Template (0,5 μg/μL), 2 μL S35-markiertes Methionin (1000 Ci/mmol bei 10 mCi/ml) und 1 μL T7-RNA-Polymerase. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Endvolumen der Reaktion auf 50 μL einzustellen. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren oder Rühren mit der Pipettenspitze und drehen Sie kurz herunter. Entsorgen Sie Spitzen und Schläuche in einem Behälter für radioaktive Abfälle.HINWEIS: Fügen Sie die Aminosäuremischung nicht ohne Leucin hinzu. Der pT7CFE1-Vektor verwendet einen T7-Promotor für die Proteinexpression. Andere Vektoren verwenden T3- oder SP6-Promotoren. In diesem Fall sollten T3- oder SP6-RNA-Polymerasen anstelle der T7-RNA-Polymerase verwendet werden. Bitte stellen Sie sicher, dass die DNA-Vorlage von hoher Reinheit ist. Die Reaktion bei 30 °C 90 min inkubieren. 10 s kurz drehen und die Röhrchen auf Eis legen. Überprüfen Sie den Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats in RRL mittels SDS-PAGE und Immunoblotting/Autoradiographie.HINWEIS: Die Menge an RRL-Extrakt, die der Spaltreaktion zugesetzt wird, sollte auf der Proteinmenge basieren, die durch die Nachweismethode (entweder Immunoblotting oder S35-Autoradiographie ) nachgewiesen werden kann. Fahren Sie mit dem In-vitro-Spaltungstest (nächster Abschnitt) fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C. 5. In-vitro-Spaltungstest mit Substraten, die mit RRL erzeugt wurden Nehmen Sie das/die erzeugte(n) mutmaßliche(n) Substrat(e), wie in Abschnitt 4 beschrieben. In diesem Protokoll wird N-Myc-DriceC211A als Modellsubstrat verwendet. Abhängig vom Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats (separat durch Immunoblot oder Autoradiographie-Analyse zu bestimmen, siehe Schritt 4.4), verwenden Sie 1-10 μL des RRL, programmiert mit dem Protein von Interesse im Spaltassay. Fügen Sie 10 μg gereinigtes Caspase-Protein hinzu, das in den Abschnitten 1, 2 und 3 erzeugt wird. Das Gesamtreaktionsvolumen wird mit Caspase-Assay-Puffer auf 50 μL gebracht. Die Reaktionen werden in einem Wasserbad bei 30 °C für 3 h inkubiert. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Kontrollen in den Spalttest aufgenommen werden. Hier kommt die katalytische Mutante DroncC318A als Kontrolle zum Einsatz. Nach 3 h stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhrchen auf Eis übertragen. Fügen Sie ein Volume LDS-Probenpuffer mit 50 mM DTT hinzu. Die Reaktion wird durch Zugabe von LDS-Probenpuffer vollständig gestoppt. Inkubieren Sie die Proben bei 75 °C in einem Hitzeblock für 10 min. Schnell drehen, durch Flicken mischen, 24 μL pro Probe einlegen und die SDS-PAGE ausführen (siehe Abschnitt 7) oder die Proben bei -20 °C lagern. 6. In-vitro-Spaltungstest mit bakteriell exprimiertem rekombinantem Substratprotein 10 μg gereinigtes Kandidatensubstrat (hier 6xHis-DriceC211A, erzeugt in den Abschnitten 1, 2 und 3) in ein 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie 10 μg der gereinigten Caspaseproteine hinzu, die in den Abschnitten 1 und 2 erzeugt werden. Das Gesamtvolumen wird mit einem Caspase-Assay-Puffer auf 50 μL erhöht. Führen Sie die Schritte 5.5 bis 5.9 aus. 7. SDS-PAGE und Immunoblotting Laden Sie die Spaltreaktionen (24 μL) auf 4%-12% Tris-Glycin- oder Bis-Tris-Gradientengele (Table of Materials) und führen Sie Proteinelektrophorese und Immunoblotting (oder Autoradiographie bei Verwendung von S35-markierten Substraten) durch, um die Ergebnisse mit Standardverfahren27,28 zu visualisieren.HINWEIS: Hier wurden in diesem Protokoll Bis-Tris-Gradientengele mit Mops-Laufpuffer und LDS-Ladepuffer verwendet. Im Allgemeinen laufen die häufig verwendeten PAGE-Protokolle von Tris-Glycine-Gelen mit dem Tris-Glycine-SDS-Laufpuffer und der SDS-Ladepuffer funktionieren gut.

Representative Results

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Caspase-Proteininduktion in E. coli, die Reinigung der rekombinanten Drosophila caspasen Dronc und Drice, die Synthese von Kandidatensubstraten und die in vitro Spaltungsreaktion mit Kandidatensubstraten (hier DriceC211A) und der Caspase Dronc. Die katalytische Mutante DriceC211A wurde in diesem Assay als Modellsubstrat verwendet, da sie keine Autoverarbeitungsaktivität aufweist (Abbildung 2A) und in voller Länge bleibt, bis sie von Droncwt. DriceC211A sollte immer als Positivkontrolle verwendet werden, um zu validieren, dass das Droncwt-Präparat enzymatische Aktivität aufweist. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Beispiel für die Expression und Reinigung rekombinanter Caspasen. Vier verschiedene rekombinante Caspasen wurden induziert und gereinigt: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt und 6xHis-DriceC211A. Die gereinigten Caspasen wurden von SDS-PAGE durchgeführt, immunoblottiert, und der Blot wurde mit einem Anti-His-Antikörper (verdünnt 1:5.000; gefolgt von Anti-Maus-IgG, HRP-verknüpftem Antikörper (1:10.000)) untersucht. Der unverarbeitete 6xHis-Dronc (proDronc) läuft mit einem relativen Molekulargewicht (MW r) von 55 kDa (Bahn 2) und der unverarbeitete 6xHis-Drice (proDrice) hat einen MWr von 35 kDa (Bahn 4). Die Autoverarbeitung der Caspasen ist durch das Auftreten von Bändern kleinerer MWr sichtbar, die aufgrund des Vorhandenseins des His-Tags am N-Terminus die großen Untereinheiten der Caspasen darstellen (Abbildung 1). Im Fall von 6x-Dronc hat die große Untereinheit eine MWr von 40 kDa (Bahn 1). Die große Untereinheit von 6x-Drice läuft mit 23 kDa (Bahn 3). Die katalytischen Mutanten 6xHis-DroncC318A und 6xHis-DriceC211A können nicht automatisch verarbeitet werden und sind nur als Proteine in voller Länge nachweisbar (Lanes 2 und 4). Abbildung 2B Um nachzuweisen, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6xHis-Droncwt-Präparat enzymatische Aktivität aufweist, wurde ein in vitro Spaltungsassay wie in diesem Protokoll beschrieben durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde die katalytische Mutante 6xHis-Dronc318A verwendet. Das Substrat war RRL-generiertes N-Myc-DriceC211A, das am N-Terminus mit einem Myc-Tag markiert ist. Nach der In-vitro-Spaltungsreaktion wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt, immunoblottiert und die Blots wurden mit einem Anti-Myc-Antikörper (verdünnt 1:1.000) inkubiert, gefolgt von Anti-Maus-IgG, HRP-verknüpftem Antikörper (1:10.000)), um N-Myc-DriceC211A nachzuweisen. Eine erfolgreiche Spaltung und damit enzymatische Aktivität der Caspase kann durch das Auftreten mindestens einer Bande kleinerer MWr im Vergleich zur volllangen, unverarbeiteten Form des Substrats nachgewiesen werden. Unverarbeitete N-Myc-Drice C211A in voller Länge hat eine MWr von 40 kDa (Bahnen 2 und 4), während die große Untereinheit von verarbeitetem N-Myc-DriceC211A mit 30 kDa (Bahn 3) läuft. Bahn 1 stellt das unprogrammierte RRL-Lysat dar (kein Plasmid/Transkript hinzugefügt). Lane 2 demonstriert die In-vitro-Produktion von DriceC211A durch RRL-Expression. Bahn 3 enthält die in vitro Spaltungsreaktion mit 6xHis-Droncwt. Bahn 4 enthält die in vitro Spaltungsreaktion mit 6xHis-DroncC318A. Abbildung 2C Eine in vitro Spaltungsreaktion, die sowohl rekombinante als auch gereinigte Caspase (6xHis-Droncwt und 6x-His-DroncC318A) und Substrat (6xHis-DriceC211A) nach diesem Protokoll verwendet, wurde mittels SDS-PAGE und immunoblot analysiert. Zur Analyse der Spaltungsreaktion wurde in diesem Immunoblot der anti-gespaltene Drice-Antikörper (verdünnt 1:5.000; gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpfter Antikörper (1:10.000)) verwendet. Der anti-gespaltene Drice-Antikörper detektiert sein Neo-Epitop in der großen Untereinheit (23 kDa) von 6xHis-DriceC211A erst nach Verarbeitung durch 6xHis-Droncwt (Bahn 1). Die katalytische Mutante 6xHis-DroncC318A ist in diesem Assay nicht in der Lage, 6xHis-Drice C211A zu verarbeiten, und 6xHis-DriceC211A in voller Länge erscheint als schwaches unverarbeitetes Band von 35 kDa (Bahn 2). Abbildung 1: Domänenstruktur der Initiator-Caspasen Caspase-9 und Dronc und der Effektor-Caspasen Caspase-3 und Drice. CARD – caspase Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne; Cys – relative Lage des katalytischen Cysteinrestes; L – große Untereinheit; S – kleine Untereinheit. Der Standort der N-terminalen Prodomänen wird angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse. (A) Immunoblot-Analyse von gereinigten rekombinanten 6xHis-Dronc- und 6xHis-Drice-Präparaten, untersucht mit einem Anti-His-Antikörper. Unbearbeitet (proDronc und proDrice) und gespalten 6xHis-Dronc und 6xHis-Drice sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. (B) Immunoblot-Analyse der In-vitro-Spaltungsreaktion von RRL-generiertem N-Myc-Drice mit Caspasen 6xHis-Droncwt (Spur 3) oder 6x-His-DroncC318A (Spur 4), die mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht wurden. Unprogrammierte und programmierte (N-Myc-DriceC211A) RRL-Reaktionen werden geladen und in den Bahnen 1 und 2 getrennt. Unverarbeitet (proDrice) und gespaltenes N-Myc-Drice sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. (C) Immunoblot-Analyse der In-vitro-Spaltungsreaktion von bakteriell exprimierten und gereinigten rekombinanten 6xHis-Drice C211A mit Caspasen 6xHis-Droncwt (Spur 1) oder 6x-His-DroncC318A (Spur 2), untersucht mit einem anti-gespaltenen Drice-Antikörper. Durchgehende Länge (proDrice) und gespaltene 6xHis-DriceC211A sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ergänzende Tabelle 1: Diese Tabelle enthält Primer, die für das Klonen in pET28a-Vektor verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Tabelle 2: Diese Tabelle enthält die Zusammensetzung der Puffer und Medien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Der Großteil unseres Wissens über Caspasen und Caspase-Funktion stammt aus intensiver Arbeit in der Apoptose in den letzten drei Jahrzehnten. Es ist sehr gut bekannt, dass Initiator-Caspasen Effektor-Caspasen proteolytisch verarbeiten, und Hunderte von Proteinen wurden während der Apoptose 5,29 als Effektor-Caspase-Substrate identifiziert. Viel weniger ist dagegen über die Funktion von Caspasen für nicht-apoptotische Prozesse bekannt und welche nicht-apoptotischen Substrate sie verarbeiten. Es ist denkbar, dass Initiatoren-Caspasen hier wichtige Entscheidungsträger sind. Während der Apoptose aktivieren sie Effektor-Caspasen, die den Zelltod verursachen. Um jedoch nicht-apoptotische Prozesse auszulösen, können sie verschiedene Proteine (außer Effektor-Caspasen) aktivieren, die den nicht-apoptotischen Prozess steuern. Dieses Protokoll testet Kandidatenproteine als Substrate des Initiators Caspase Dronc in Drosophila 17,30.

Die im Spalttest zu testenden Substrate können entweder in einem in vitro zellfreien Expressionssystem für Säugetiere wie RRL oder durch rekombinante Expression in E. coli hergestellt werden. Es gibt mehrere Vorteile für die In-vitro-Expression mit RRL gegenüber der bakteriellen Expression. Das RRL-Expressionsprotokoll ist einfach und schnell, so dass viele verschiedene Substrate parallel vorbereitet werden können. In vielen Fällen kann der RRL-Extrakt, der das interessierende Protein enthält, vor der Verwendung im Spalttest bei -80 °C gelagert werden (obwohl dies für jedes Substrat separat bestimmt werden muss). Das mutmaßliche Substrat kann mit S35-Met markiert werden, was eine einfache Analyse durch Autoradiographie nach SDS-PAGE ermöglicht. Das ist vor allem dann sinnvoll, wenn kein substratspezifischer Antikörper zur Verfügung steht. Alternativ, wenn eine S35-Met-Kennzeichnung nicht gewünscht ist, kann das mutmaßliche Substrat mit gängigen Tags wie Flag-, HA- oder Myc-Tags markiert werden, was die Erkennung von Caspase-Spaltung durch Immunoblotting ermöglicht.

Es muss nachdrücklich betont werden, dass der Erfolg dieses Protokolls von der sorgfältigen und konsequenten Reinigung der rekombinanten Dronc- und Drice-Proteine abhängt. Leider können diese Proteine nicht – auch nicht kurzfristig – weder im Kühlschrank noch gefroren gelagert werden. Sie verlieren die enzymatische Aktivität über Nacht in jeder gespeicherten Form. Daher müssen sie am Tag des Spalttests frisch zubereitet werden. Unabhängig von dem/den getesteten Kandidatenprotein(en) sollte DriceC211A immer als Positivkontrolle verwendet werden, um die enzymatische Aktivität des Droncwt-Präparats zu validieren (siehe Abbildung 2B,C). Alternativ kann die Aktivität der Dronc- und Drice-Präparate auch durch in vitro-Spaltung von fluorogenen synthetischen Tetrapeptidsubstraten 2,9,31 getestet werden.

Wenn Antikörper zum Nachweis der Kandidatensubstrate verwendet werden, müssen sie vom Anwender32,33 validiert werden. Das gilt auch für kommerziell erhältliche Antikörper, die Epitop-Tags wie Flag, HA, Myc oder andere detektieren. Eine schlechte Antikörperqualität kann wichtige Ergebnisse verschleiern. Eine doppelte Epitopmarkierung der Kandidatensubstrate sowohl auf dem N- als auch auf dem C-Terminus mit unterschiedlichen Tags wird ebenfalls empfohlen34. Wenn eine Spaltung auftritt, hilft die doppelte Markierung, beide Spaltprodukte zu verfolgen, und kann helfen, aufzuklären, ob eine Spaltung an einer oder mehreren Stellen auftritt.

Während dieses Protokoll das bekannte biologische Substrat von Dronc, Drice, leicht validiert, gibt es auch Einschränkungen. Eine Einschränkung besteht darin, dass es sich um ein In-vitro-Protokoll mit rekombinanten Proteinen handelt. In diesen Assays liegen die Caspasen in einer unphysiologisch hohen Konzentration vor, was aus der Beobachtung hervorgeht, dass sie in E. coli spontan autoprozessieren können . Die spontane Autoverarbeitung findet unter den physiologischen Bedingungen in der Regel nicht statt. Diese hohe Caspase-Konzentration kann zu Fehlaktivitäten führen, die zu falsch positiven Ergebnissen führen. Falsch positive Ergebnisse können durch Senkung der Caspase-Konzentration in der In-vitro-Spaltungsreaktion eliminiert werden. Darüber hinaus sind, wie im Folgenden ausführlicher beschrieben, zusätzliche Assays erforderlich, um echte Substrate zu bestätigen und Fehlalarme zu eliminieren.

Die rekombinanten Caspasen haben möglicherweise nicht die gleiche Spezifität wie in ihrer normalen zellulären Umgebung in vivo. Zum Beispiel kann die Aktivität von Caspasen durch posttranslationale Modifikationen modifiziert werden. Diese sind auf den rekombinanten Proteinen nicht vorhanden. Darüber hinaus werden in vivo Initiator-Caspasen, einschließlich Dronc, in große Proteinkomplexe wie das Apoptosom eingebaut. Unter den Bedingungen dieses Protokolls wird die Bildung des Apoptosoms nicht erreicht. Dies würde eine rekombinante Expression von Drosophila Apaf-1 (alias Dark oder Hac-1)35-37 erfordern, die ihre eigenen Herausforderungen hat. Daher hat Dronc in vitro möglicherweise nicht die gleiche Spezifität wie in vivo.

Denkbar ist auch, dass Dronc für nicht-apoptotische Prozesse in einen anderen Proteinkomplex eingebaut wird. Dies könnte eine andere Spaltspezifität als Dronc verleihen, was auch erklären könnte, warum Dronc unter nicht-apoptotischen Bedingungen keine Apoptose induziert. In diesem Zusammenhang verwendet CasCleave die bekannten Spaltungskonsensstellen, um neue Caspase-Substrate vorherzusagen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die gleichen Spaltkonsensstellen auch für nicht-apoptotische Prozesse verwendet werden. Tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass Caspase-3 seine bevorzugte Konsensusstelle während eines nicht-apoptotischen Prozesses im sich entwickelnden auditorischen Hirnstamm im Hühnerembryo38 ändert. Wenn Initiator-Caspasen in verschiedene Proteinkomplexe eingebaut werden, können sie eine unterschiedliche Spezifität aufweisen und daher bei verschiedenen Konsensussequenzen spalten.

Diese Einschränkungen zeigen, dass es nicht ausreicht, sich ausschließlich auf die in diesem Protokoll beschriebenen In-vitro-Spaltungstests zu verlassen. Es sollten alternative Ansätze verwendet werden, um die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse weiter zu validieren. Idealerweise sollten In-vivo-Assays verwendet werden, um die folgenden Fragen zu beantworten: Wird das Kandidatenprotein proteolytisch während des nicht-apoptotischen Prozesses in vivo verarbeitet? Wenn ja, wird die gleiche Spaltstelle in vivo und in vitro verwendet? Was ist die Konsequenz, wenn die Spaltung durch Mutagenese der Spaltstelle blockiert wird? Ist die Verarbeitung des Kandidatensubstrats von Caspasen abhängig und wenn ja, welche? Welche Rolle spielen die Spaltfragmente für den nicht-apoptotischen Prozess? Diese Fragen können in genetischen Modellorganismen wie C. elegans und Drosophila mit genetischen und transgenen Standardmethoden leicht beantwortet werden.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine zuverlässige und konsistente Methode zur Herstellung enzymatisch aktiver Caspasen, insbesondere der Drosophila-Caspasen Dronc und Drice . Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist es, zu untersuchen, ob Dronc Kandidatensubstrate in vitro spalten kann, die durch genetische, biochemische oder bioinformatische Ansätze identifiziert wurden. Wie im vorherigen Absatz erläutert, sind zusätzliche Assays erforderlich, um diese Proteine als Caspase-Substrate in vivo zu validieren. Angesichts des Erhaltungsgrades von Caspase-Genen in Metazoen sollte es möglich sein, dieses Protokoll auch an Caspasen anderer Organismen anzupassen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Elif Kamber-Kaya für ihre Hilfe bei der Etablierung des Protokolls im Labor. Dr. Guy Salvesen stellte freundlicherweise die DriceC211A Mutante9 zur Verfügung. Diese Arbeit wurde durch einen MIRA-Preis des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) der National Institutes of Health (NIH) unter der Fördernummer 2R35GM118330 finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Materials

Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001
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References

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Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).
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