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Bioengineering

In vitro Essais de clivage utilisant des caspases de drosophile recombinantes purifiées pour le criblage de substrats

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/64392
,
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology,UMass Chan Medical School

Summary

Nous présentons ici un protocole pour exprimer et purifier les caspases recombinantes de Drosophila Dronc et Drice, et leur utilisation dans des tests de clivage in vitro .

Abstract

Les caspases sont des protéases de mort cellulaire très spécifiques qui sont impliquées dans les processus apoptotiques et non apoptotiques. Alors que le rôle des caspases pendant l’apoptose a été très bien défini et que de nombreux substrats protéolytiques apoptotiques des caspases ont été identifiés et caractérisés, le rôle des caspases dans les processus non apoptotiques n’est pas bien compris. En particulier, peu de substrats non apoptotiques de caspases ont été identifiés jusqu’à présent. Ici, afin de faciliter l’identification et la caractérisation des substrats potentiels de caspases, un protocole qui permet de tester des substrats candidats dans des essais de clivage de caspases in vitro est décrit. Ce protocole comprend la production et la purification de protéines de caspase recombinantes, la production des substrats candidats par recombinaison ou dans un système d’expression acellulaire, et la réaction de clivage in vitro suivie de SDS-PAGE et d’immunoblotting. Ce protocole est adapté pour les caspases Dronc et Drice de Drosophile , mais peut facilement être adapté aux caspases d’autres organismes, y compris les mammifères.

Introduction

La mort cellulaire programmée ou l’apoptose est exécutée par une classe de protéases de mort cellulaire hautement spécialisées appelées caspases (examinées dans la référence1). Les caspases sont des protéases Cys qui contiennent un résidu Cys dans le site catalytique. Ils ont défini des sites de clivage consensuels et clivent les substrats protéolytiquement après les résidus d’Asp (bien que la caspase Dronc de Drosophila ait également été signalée comme clivage après résidus de Glu2). Ils sont subdivisés en caspases initiales (également appelées apicales ou en amont) et effectrices (bourreau ou aval). Les caspases initiatrices activent les caspases effectrices. Par exemple, chez les mammifères, l’initiateur caspase-9 clive et active l’effecteur caspase-33. De même, chez Drosophila melanogaster, la caspase-9-orthologue Dronc clive et active la caspase-3-orthologue Drice 2,4. Lors de l’apoptose, les caspases effectrices clivent des centaines de substrats conduisant à la mort de la cellule5.

Les caspases sont synthétisées sous forme de proenzymes inactives (zymogènes) dans la cellule. Sous cette forme, ils contiennent un prodomaine N-terminal, une grande sous-unité avec les Cys catalytiques dans la partie centrale de la proenzyme et une petite sous-unité à l’extrémité C 1 (Figure 1). Le mécanisme d’activation est différent entre les caspases initiatrices et effectrices. Les caspases initiatrices (Caspase-9, Dronc) nécessitent une dimérisation pour l’activation, qui se produit par incorporation dans un grand complexe protéique, appelé apoptosome6. Pour l’incorporation dans l’apoptosome, Caspase-9 et Dronc portent un domaine d’activation et de recrutement des caspases (CARD) dans le prodomaine N-terminal (Figure 1). Le composant apoptosome Apaf-1 contient également un CARD et recrute Caspase-9 ou Dronc via l’interaction CARD/CARD dans l’apoptosome 3,6,7. Bien que la caspase-9 et le dronc puissent être traités protéolytiquement dans l’apoptosome, ce traitement n’est pas entièrement nécessaire pour l’activité enzymatique 8,9.

En revanche, les caspases effectrices (Caspase-3, Drice) ne portent pas de CARD dans leurs procasts et ne sont pas incorporées dans de grands complexes protéiques pour l’activation1. Ils dépendent du clivage protéolytique par la Caspase-9 active ou la Dronc1, respectivement. La caspase effectrice active forme un tétramère composé de deux grandes et deux petites sous-unités, et contient donc deux sites catalytiques (Figure 1). Fait important pour ce protocole, l’expression recombinante des caspases dans E. coli provoque l’auto-traitement et l’activation des caspases, y compris Drice 10 et Dronc 2,8,9,11,12, même en l’absence d’Apaf-1. Cet auto-traitement permet d’effectuer des essais de clivage in vitro de substrats candidats avec la protéine de caspase recombinante.

Les caspases ne sont pas seulement impliquées dans l’apoptose, mais elles peuvent aussi avoir de nombreuses fonctions non apoptotiques, y compris la prolifération, la différenciation, la migration cellulaire, l’élagage neuronal, l’immunité innée, et d’autres13,14,15. On ignore actuellement comment les cellules peuvent survivre malgré la présence de caspases actives au cours de processus non apoptotiques. Il est possible que ces cellules activent les caspases uniquement à des niveaux sublétaux16 ou qu’elles séquestrent les caspases actives dans des compartiments non apoptotiques de la cellule tels que la membrane plasmique17,18. Par conséquent, l’identification et la vérification des substrats non apoptotiques révéleront non seulement comment les caspases interviennent dans les processus non apoptotiques, mais peuvent également aider à comprendre comment les cellules peuvent survivre en présence de caspases actives.

Les protéines candidates comme substrats de caspases peuvent être identifiées à l’aide de méthodes génétiques et biochimiques. Les protéines identifiées peuvent être vérifiées pour la présence des sites de clivage de Dronc consensuels. Cela peut être fait en inspectant visuellement la séquence protéique ou en utilisant des outils bioinformatiques en ligne plus sophistiqués tels que CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Ces outils utilisent les sites de clivage consensuels connus des caspases et des considérations structurelles pour prédire de nouvelles cibles de caspases. Bien que CasCleave incorpore l’information des substrats vérifiés des caspases-1, -3, -6, -7 et -8 humaines, il peut néanmoins également être utile aux fins décrites ici car ces caspases et leurs sites de clivage consensuels sont bien conservés. Cependant, comme le site de clivage de Dronc n’est pas bien défini (deux études ont identifié deux sites de clivage optimaux différents, TATD/E2 et LALD9), les substrats candidats sont également examinés pour la présence d’autres sites de clivage de la caspase, y compris Drice.

Pour valider les substrats prédits des caspases, des dosages supplémentaires sont nécessaires. L’un de ces tests est la démonstration qu’une caspase donnée peut réellement cliver la protéine candidate. Ici, nous fournissons un protocole pratique pour les tests de clivage de la caspase in vitro . En utilisant ce protocole, les substrats candidats sont testés avec Dronc comme caspase. Ils peuvent également être testés comme substrats de Drice. Bien que ce protocole soit écrit pour les caspases Dronc et Drice, il peut également être adapté pour les caspases d’autres organismes.

L’extraction et la purification du Dronc et du Drice ainsi que le test de clivage in vitro doivent être effectués le même jour en raison de la perte d’activité catalytique de ces caspases. Ce protocole a été modifié et optimisé par rapport aux publications précédentes 8,9,11,12,21,22. Dans ce protocole, quatre protéines de caspases différentes sont exprimées de manière recombinante dans la souche BL21 (DE3) pLysS d’E. coli. Ces protéines sont : 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt et 6xHis-DriceC211A. Chacune de ces protéines est marquée avec 6 résidus d’histidine (6xHis) à l’extrémité N pour la purification. Dronc wt et Dricewt sont les protéines de type sauvage et peuvent s’auto-traiter en caspase active lors de l’expression recombinante. DroncC318A et DriceC211A codent des formes mutantes de Dronc et Drice qui changent le résidu catalytique Cys en un résidu Ala. Ces constructions sont inactives catalytiquement et ne peuvent pas être traitées automatiquement (voir Figure 2A). Ils sont utilisés comme témoins dans le test de clivage. Étant donné que le DriceC211A ne peut pas être traité automatiquement, il est également utilisé comme substrat modèle pour Droncwt dans le test de clivage in vitro décrit ici.

Protocol

1. Expression de caspases recombinantes dans les bactéries Cloner le gène d’intérêt (caspase ou substrat putatif) en un vecteur d’expression bactérienne avec marque(s) N- et/ou C-terminal(s) en utilisant les protocoles standard23.NOTE: Les marqueurs peuvent augmenter la solubilité des protéines recombinantes et sont utilisés pour la purification des protéines recombinantes. Ici, Dronc, Drice et leurs mutants catalytiques sont clonés dans le vecteur pET28a, qui fournit une balise N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-DriceC211A); (pour des renseignements sur les amorces, voir le tableau supplémentaire 1). Transformer les vecteurs avec les gènes d’intérêt en cellules compétentes BL21 (DE3) pLysS E. coli en utilisant des procédures standard23,24. Plaquer le mélange de transformation sur des plaques de gélose LB avec l’antibiotique approprié (kanamycine en cas de pET28a) pour sélectionner les bactéries transformées. (Voir le tableau supplémentaire 2.) Prélever une colonie dans l’assiette et inoculer dans 5 mL de milieu LB contenant l’antibiotique approprié pour se développer pendant la nuit à 37 °C à 220 rpm sur une plate-forme agitée. Le lendemain, préparer 30 à 50 mL (par échantillon) de milieu LB avec un antibiotique et ajouter 1 mL de la culture cultivée pendant la nuit. La densité optique à 600 nm (DO600) à l’aide d’un biophotomètre/spectrophotomètre doit être comprise entre 0,1 et 0,2. Cultiver la culture à 37 °C à 220 tr/min sur une plate-forme vibrante jusqu’à ce que le diamètre de600 OD atteigne 0,6. Vérifiez l’OD600 toutes les heures jusqu’à ce qu’il atteigne 0,6. Cela prend environ 2 à 3 h. Pour induire l’expression de protéines (caspases), ajouter IPTG à une concentration finale de 0,1-0,2 mM (diluer 1:1,000-1:500 à partir du stock IPTG, voir le tableau supplémentaire 2). Cultiver les cultures pendant 3 h à 30 °C à 220 tr/min.REMARQUE: Le temps et la température dépendent du type de protéine exprimé et de sa solubilité. Ces conditions peuvent devoir être ajustées si différentes caspases ou substrats sont exprimés. Après 3 h, faire tourner les cultures dans des tubes à centrifuger de 50 ml pendant 20 min à 4 °C à 2 000 x g. Jetez le surnageant et continuez avec la pastille.Remarque : Le protocole peut être arrêté à ce stade et continué plus tard. Les granulés bactériens peuvent être congelés à -80 °C. 2. Extraction de caspases recombinantes à petite échelle Retirer les tubes congelés avec les cultures granulées de stockage à -80 °C et les garder sur la glace pendant 10 minutes pour ramollir le granulé. Après 10 minutes, ajouter 0,6 mL de tampon de lyse cellulaire bactérienne (tableau supplémentaire 2) complété par des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés, 10 mg/mL de lysozyme et 50 U/mL de benzonase dans les tubes contenant des pastilles à l’aide d’un contrôleur de pipette avec une pipette sérologique de 1 mL. Avec la même pointe de pipette, dissoudre la pastille en pipetant de haut en bas jusqu’à ce qu’une solution jaune pâle transparente sans aucune particule de pastille soit visible. Incuber pendant 30 min sur la glace. Transférer le lysat dans des tubes de centrifugation appropriés et centrifuger les lysats à 17 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Transférer les surnageants dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. C’est l’extrait brut contenant les caspases. Gardez les tubes sur de la glace et procédez à la purification avec de l’agarose Ni-NTA. 3. Purification à petite échelle des caspases marquées His Ajouter 0,2 mL de la suspension à 50 % d’agarose Ni-NTA à chaque tube des extraits de caspases de l’étape 2.5. Faire tourner les tubes sur un rotateur bout à bout pendant 1 h à 4 °C. Après 1 h, ajouter l’extrait avec l’agarose Ni-NTA à 1 mL de colonnes en polypropylène avec la pointe intacte, placées dans une grille. Laisser reposer pendant 5 min. Après 5 min, retirez le bouchon des colonnes et laissez le surnageant s’écouler par gravité. Ajouter délicatement 1 mL du tampon de lavage (tableau supplémentaire 2) aux colonnes sans déranger la résine garnie d’agarose Ni-NTA et la laver par gravité. Effectuez l’étape de lavage trois fois. Pour l’élution des caspases, placer des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL sous la buse collectrice des colonnes après vidange complète du tampon de lavage. Ajouter 0,5 mL du tampon d’élution (complété par 1x inhibiteurs de protéase immédiatement avant utilisation) à chaque colonne et recueillir l’éluat dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.NOTE: L’éluat purifié fin sera de couleur transparente. Gardez les éluats sur la glace et mesurez la concentration de protéines par le test Bradford25. Confirmer la pureté/homogénéité des caspases purifiées par SDS-PAGE suivi de la coloration Coomassie Blue26.REMARQUE : Le rendement d’une culture de 50 mL LB varie entre 0,5 et 1,5 mg de protéine de caspase. Étant donné que 0,5 mL de tampon d’élution est utilisé pour l’élution, la concentration varie de 1 à 3 mg/mL. Il est important d’utiliser les éluats de caspases purifiés pour les tests de clivage in vitro le même jour de lyse et de purification car ces préparations de caspases perdent de l’activité pendant la nuit. 4. Expression du substrat putatif de la caspase dans les systèmes d’expression acellulaires NOTE: Dans ce protocole, Drice, le substrat naturel de Dronc, est préparé à la fois par expression recombinante dans E. coli (voir rubrique 3 ci-dessus) et par expression dans le lysat de réticulocytes de lapin (RRL), un système d’expression acellulaire de mammifère (cette section, voir ci-dessous). Cloner le gène du substrat putatif dans un vecteur d’expression contenant un promoteur T7, T3 ou SP6 en utilisant des procédures standard23.NOTE: Dans ce protocole, DriceC211A est utilisé comme substrat modèle et a été cloné dans le vecteur pT7CFE1-N-Myc, qui porte un promoteur T7 pour l’expression génique et marque le substrat protéique putatif avec un marqueur Myc N-terminal pour la détection par immunobuvardage. Dans RRL, les substrats candidats peuvent être synthétisés radioactivement ou non radioactivement.Synthèse non radioactive : Dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL, ajouter 25 μL de RRL, 2 μL de tampon réactionnel, 0,5 μL de mélange d’acides aminés moins la leucine (1 mM), 0,5 μL de mélange d’acides aminés moins méthionine (1 mM), 1 μL d’inhibiteur de ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de matrice d’ADN (0,5 μg/μL) et 1 μL de T7-ARN polymérase. Ajouter de l’eau exempte de nucléases pour ajuster le volume final de la réaction à 50 μL. Mélanger doucement les composants en les pipetant ou en les remuant avec l’embout de la pipette et en les tournant brièvement.REMARQUE: Le lysat RRL contient 100-200 mg / mL des protéines endogènes. Pour les réactions de traduction in vitro , ajouter le RRL à une concentration de 50% (ici 25 μL/50 μL de réaction). Synthèse radioactive : Dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL, ajouter 25 μL de lysat RRL, 2 μL de tampon réactionnel, 0,5 μL de mélange d’acides aminés moins méthionine (1 mM), 1 μL d’inhibiteur de ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de matrice d’ADN (0,5 μg/μL), 2 μL de méthionine marquée S35 (1000 Ci/mmol à 10 mCi/mL) et 1 μL de T7-ARN polymérase. Ajouter de l’eau exempte de nucléases pour ajuster le volume final de la réaction à 50 μL. Mélanger doucement les composants en les pipetant ou en les remuant avec l’embout de la pipette et en les tournant brièvement. Jetez les embouts et les tubes dans un conteneur à déchets radioactifs.REMARQUE: N’ajoutez pas le mélange d’acides aminés sans leucine. Le vecteur pT7CFE1 utilise un promoteur T7 pour l’expression des protéines. D’autres vecteurs utilisent des promoteurs T3 ou SP6. Dans ce cas, les ARN polymérases T3 ou SP6 doivent être utilisées à la place de l’ARN polymérase T7. Veuillez vous assurer que le modèle d’ADN est d’une grande pureté. Incuber la réaction à 30 °C pendant 90 min. Tourner brièvement pendant 10 s et placer les tubes sur de la glace. Vérifier le niveau d’expression du substrat putatif dans RRL par SDS-PAGE et immunoblot/autoradigraphie.REMARQUE : La quantité d’extrait de RRL ajoutée à la réaction de clivage doit être basée sur la quantité de protéine qui peut être détectée par la méthode de détection (immunoblot ou autoradiographie S35 ). Passer au test de clivage in vitro (section suivante) ou le conserver à -80 °C. 5. Essai de clivage in vitro avec substrats générés avec RRL Prenez le(s) substrat(s) présumé(s) généré(s), tel que décrit à la section 4. Dans ce protocole, N-Myc-DriceC211A est utilisé comme substrat modèle. Selon le niveau d’expression du substrat putatif (à déterminer séparément par immunoblot ou par autoradiographie, voir étape 4.4), utiliser 1 à 10 μL de RRL programmé avec la protéine d’intérêt dans le test de clivage. Ajouter 10 μg de protéine de caspase purifiée générée dans les sections 1, 2 et 3. Porter le volume total de réaction à 50 μL avec un tampon de dosage de caspases. Incuber les réactions au bain-marie à 30 °C pendant 3 h. Assurez-vous d’inclure les témoins appropriés dans le test de clivage. Ici, le mutant catalytique DroncC318A est utilisé comme témoin. Après 3 h, arrêter les réactions en transférant les tubes sur de la glace. Ajouter un volume de tampon d’échantillon LDS contenant 50 mM de TNT. La réaction est complètement arrêtée avec l’ajout d’un tampon d’échantillon LDS. Incuber les échantillons à 75 °C dans un bloc thermique pendant 10 min. Essorer rapidement, mélanger par effleurement, charger 24 μL par échantillon et exécuter le SDS-PAGE (voir rubrique 7) ou stocker les échantillons à -20 °C. 6. Essai de clivage in vitro avec une protéine substrat recombinante exprimée par des bactéries Ajouter 10 μg de substrat candidat purifié (ici 6xHis-DriceC211A, généré dans les sections 1, 2 et 3) dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL. Ajouter 10 μg des protéines de caspases purifiées générées dans les sections 1 et 2. Porter le volume total à 50 μL en utilisant un tampon de dosage de caspases. Suivez les étapes 5.5 à 5.9. 7. FDS-PAGE et immunoblot Charger les réactions de clivage (24 μL) sur des gels à gradient Tris-Glycine ou Bis-Tris à 4 % à 12 % (Table des matières) et effectuer l’électrophorèse des protéines et l’immunoblotting (ou l’autoradiographie si vous utilisez des substrats marqués S35) pour visualiser les résultats à l’aide des procédures standard27,28.REMARQUE: Ici, dans ce protocole, des gels de gradient Bis-Tris avec tampon de fonctionnement Mops et tampon de chargement LDS ont été utilisés. En général, les protocoles PAGE couramment utilisés des gels Tris-Glycine fonctionnent avec le tampon de fonctionnement Tris-Glycine-SDS et le tampon de chargement SDS fonctionne bien.

Representative Results

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour l’induction de la protéine caspase dans E. coli, la purification des caspases recombinantes Drosophila Dronc et Drice, la synthèse des substrats candidats et la réaction de clivage in vitro avec les substrats candidats (ici DriceC211A) et la caspase Dronc. Le mutant catalytique DriceC211A a été utilisé comme substrat modèle dans ce test car il n’a pas d’activité d’auto-traitement (Figure 2A) et reste sur toute sa longueur jusqu’à ce qu’il soit clivé par Droncwt. Le driceC211A doit toujours être utilisé comme témoin positif pour valider que la préparation Droncwt a une activité enzymatique. La figure 2A fournit un exemple représentatif de l’expression et de la purification des caspases recombinantes. Quatre caspases recombinantes différentes ont été induites et purifiées : 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt et 6xHis-DriceC211A. Les caspases purifiées ont été gérées par SDS-PAGE, immunoblottées, et le transfert a été sondé avec un anticorps anti-His (dilué 1:5 000; suivi d’anticorps anti-souris IgG, HRP-linked (1:10 000)). Le 6xHis-Dronc non traité (proDronc) fonctionne à un poids moléculaire relatif (MW r) de 55 kDa (voie 2) et le 6xHis-Drice non transformé (proDrice) a un MWr de 35 kDa (voie 4). L’auto-traitement des caspases est visible par l’apparition de bandes de plus petits MWr qui, en raison de la présence de l’étiquette His, à l’extrémité N, représentent les grandes sous-unités des caspases (Figure 1). Dans le cas de 6x-Dronc, la grande sous-unité a un MWr de 40 kDa (voie 1). La grande sous-unité de 6x-Drice fonctionne à 23 kDa (voie 3). Les mutants catalytiques 6xHis-DroncC318A et 6xHis-DriceC211A ne parviennent pas à s’auto-traiter et ne sont détectables que sous forme de protéines pleine longueur (voies 2 et 4). Graphique 2B Pour démontrer que la préparation 6xHis-Droncwt produite et purifiée par des bactéries a une activité enzymatique, un test de clivage in vitro tel que décrit dans ce protocole a été effectué. Comme témoin négatif, le mutant catalytique 6xHis-DroncC318A a été utilisé. Le substrat était généré par RRL N-Myc-DriceC211A, qui est marqué avec une étiquette Myc à l’extrémité N. Après la réaction de clivage in vitro, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, immunoblotted et les blots ont été incubés avec un anticorps anti-Myc (dilué 1:1 000) suivi d’anticorps anti-souris IgG, HRP-linked (1:10 000)) pour détecter N-Myc-DriceC211A. Un clivage réussi et donc une activité enzymatique de la caspase peuvent être démontrés par l’apparition d’au moins une bande de plus petite taille MWr par rapport à la forme pleine longueur et non traitée du substrat. Le N-Myc-Drice C211A non transformé et pleine longueur a un MWr de 40 kDa (voies 2 et 4), tandis que la grande sous-unité de N-Myc-DriceC211A traitée fonctionne à 30 kDa (voie 3). La voie 1 représente le lysat RRL non programmé (aucun plasmide/transcription ajouté). La voie 2 démontre la production in vitro de DriceC211A par expression RRL. La voie 3 contient la réaction de clivage in vitro avec 6xHis-Droncwt. La voie 4 contient la réaction de clivage in vitro avec 6xHis-DroncC318A. Graphique 2C Une réaction de clivage in vitro utilisant à la fois de la caspase recombinante et purifiée (6xHis-Droncwt et 6x-His-DroncC318A) et du substrat (6xHis-DriceC211A) selon ce protocole, a été analysée par SDS-PAGE et immunoblot. Pour l’analyse de la réaction de clivage, l’anticorps anti-clivage de Drice (dilué 1:5 000; suivi d’anticorps anti-IgG de lapin, lié au HRP (1:10 000)) a été utilisé dans ce transfert immunoblot. L’anticorps anti-clivage de Drice ne détecte son néo-épitope dans la grande sous-unité (23 kDa) de 6xHis-DriceC211A qu’après traitement par 6xHis-Droncwt (voie 1). Le mutant catalytique 6xHis-DroncC318A est incapable de traiter le 6xHis-Drice C211A dans ce test et le 6xHis-DriceC211A pleine longueur apparaît comme une faible bande non traitée de 35 kDa (voie 2). Figure 1 : Structure du domaine des caspases initiatrices Caspase-9 et Dronc et des caspases effectrices Caspase-3 et Drice. CARD – domaine d’activation et de recrutement des caspases; Cys – emplacement relatif du résidu catalytique de cystéine; L – grande sous-unité; S – petite sous-unité. L’emplacement des prodomaines N-terminal est indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Résultats représentatifs. (A) Analyse immunoblot de préparations recombinantes purifiées 6xHis-Dronc et 6xHis-Drice, sondées avec un anticorps anti-He. Non transformé (proDronc et proDrice) et clivé 6xHis-Dronc et 6xHis-Drice sont indiqués par des flèches. Les marqueurs MW sont indiqués à gauche. (B) Analyse immunoblot de la réaction de clivage in vitro du N-Myc-Drice généré par RRL avec des caspases 6xHis-Droncwt (voie 3) ou 6x-His-DroncC318A (voie 4) sondés avec un anticorps anti-Myc. Les réactions RRL non programmées et programmées (N-Myc-DriceC211A) sont chargées et séparées dans les voies 1 et 2. Le N-Myc-Drice non transformé (proDrice) et clivé est indiqué par des flèches. Les marqueurs MW sont indiqués à gauche. (C) Analyse immunoblot de la réaction de clivage in vitro du 6xHis-DriceC211A recombinant exprimé et purifié par bactérie avec des caspases 6xHis-Droncwt (voie 1) ou 6x-His-DroncC318A (voie 2), sondé avec un anticorps anti-clivage de Drice. Les 6xHis-DriceC211A pleine longueur (proDrice) et clivé sont indiqués par des flèches. Les marqueurs MW sont indiqués à gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Tableau supplémentaire 1 : Ce tableau contient les amorces utilisées pour le clonage dans le vecteur pET28a. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Tableau supplémentaire 2 : Ce tableau contient la composition des tampons et des milieux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La majeure partie de nos connaissances sur les caspases et leur fonction provient d’un travail intense sur l’apoptose au cours des trois dernières décennies. Il est très bien établi que les caspases initiatrices traitent protéolytiquement les caspases effectrices, et des centaines de protéines ont été identifiées comme substrats effecteurs de caspases au cours de l’apoptose 5,29. En revanche, on en sait beaucoup moins sur la fonction des caspases pour les processus non apoptotiques et sur les substrats non apoptotiques qu’elles traitent. Il est concevable que les caspases initiatrices soient des décideurs clés ici. Au cours de l’apoptose, ils activent les caspases effectrices provoquant la mort cellulaire. Cependant, pour déclencher des processus non apoptotiques, ils peuvent activer différentes protéines (autres que les caspases effectrices), qui contrôlent le processus non apoptotique. Ce protocole teste des protéines candidates comme substrats de l’initiateur caspase Dronc chez Drosophila 17,30.

Les substrats à tester dans le test de clivage peuvent être produits soit dans un système d’expression cellulaire in vitro de mammifères tel que RRL, soit par expression recombinante dans E. coli. Il existe plusieurs avantages pour l’expression in vitro en utilisant RRL par rapport à l’expression bactérienne. Le protocole d’expression RRL est simple et rapide, ce qui permet de préparer de nombreux substrats différents en parallèle. Dans de nombreux cas, l’extrait RRL contenant la protéine d’intérêt peut être stocké à -80 °C avant d’être utilisé dans le test de clivage (bien que cela doive être déterminé séparément pour chaque substrat). Le substrat putatif peut être marqué avec S35-Met, ce qui permet une analyse facile par autoradiographie après SDS-PAGE. Ceci est particulièrement utile si aucun anticorps spécifique au substrat n’est disponible. Alternativement, si l’étiquetage S35-Met n’est pas souhaité, le substrat putatif peut être étiqueté avec des étiquettes courantes telles que les étiquettes Flag, HA ou Myc, ce qui permet de détecter le clivage de la caspase par immunoblotting.

Il convient de souligner avec force que le succès de ce protocole dépend de la purification minutieuse et cohérente des protéines Dronc et Drice recombinantes. Malheureusement, ces protéines ne peuvent pas être conservées – même à court terme – ni au réfrigérateur ni congelées. Ils perdent l’activité enzymatique du jour au lendemain sous n’importe quelle forme stockée. Par conséquent, ils doivent être préparés fraîchement le jour du test de clivage. Quelle que soit la ou les protéines candidates testées, DriceC211A doit toujours être utilisé comme témoin positif pour valider l’activité enzymatique de la préparation Droncwt (voir Figure 2B,C). Alternativement, l’activité des préparations de Dronc et de Drice peut également être testée par clivage in vitro de substrats de tétrapeptides synthétiques fluorogéniques 2,9,31.

Si des anticorps sont utilisés pour détecter les substrats candidats, ils doivent être validés par l’utilisateur32,33. Cela s’applique également aux anticorps disponibles dans le commerce qui détectent les marqueurs d’épitopes tels que Flag, HA, Myc ou autres. Une mauvaise qualité des anticorps peut obscurcir des résultats importants. Il est également recommandé d’étiqueter à double épitope les substrats candidats aux extrémités N et C avec des étiquettes différentes34. En cas de clivage, le double marquage aide à retracer les deux produits de clivage et peut aider à élucider si le clivage se produit à un ou plusieurs sites.

Bien que ce protocole valide facilement le substrat biologique connu de Dronc, Drice, il y a aussi des limites. Une limitation est qu’il s’agit d’un protocole in vitro avec des protéines recombinantes. Dans ces essais, les caspases sont présentes à une concentration non physiologiquement élevée, ce qui est évident à partir de l’observation qu’elles peuvent spontanément s’auto-traiter dans E. coli. L’auto-traitement spontané ne se produit généralement pas dans les conditions physiologiques. Cette concentration élevée de caspases peut provoquer une activité parasite entraînant des faux positifs. Les faux positifs peuvent être éliminés en abaissant la concentration de caspases dans la réaction de clivage in vitro . En outre, comme indiqué plus en détail ci-dessous, des tests supplémentaires sont nécessaires pour confirmer les substrats authentiques et éliminer les faux positifs.

Les caspases recombinantes peuvent ne pas avoir la même spécificité que dans leur environnement cellulaire normal in vivo. Par exemple, l’activité des caspases peut être modifiée par des modifications post-traductionnelles. Ceux-ci ne sont pas présents sur les protéines recombinantes. De plus, in vivo, les caspases initiatrices, y compris Dronc, sont incorporées dans de grands complexes protéiques tels que l’apoptosome. Dans les conditions de ce protocole, la formation de l’apoptosome n’est pas atteinte. Cela nécessiterait une expression recombinante de Drosophila Apaf-1 (alias Dark ou Hac-1)35-37 qui a ses propres défis. Par conséquent, in vitro, Dronc peut ne pas avoir la même spécificité qu’il a in vivo.

Il est également concevable que Dronc soit incorporé dans un complexe protéique différent pour les processus non apoptotiques. Cela peut conférer une spécificité de clivage différente de celle de Dronc, ce qui pourrait également expliquer pourquoi Dronc n’induit pas d’apoptose dans des conditions non apoptotiques. Dans le même ordre d’idées, CasCleave utilise les sites de consensus de clivage connus pour prédire de nouveaux substrats de caspases. Cependant, on ne sait pas si les mêmes sites de consensus de clivage sont également utilisés pour les processus non apoptotiques. En fait, récemment, il a été démontré que la caspase-3 change son site de consensus préféré au cours d’un processus non apoptotique dans le tronc cérébral auditif en développement de l’embryon de poussin38. De même, si les caspases initiatrices sont incorporées dans différents complexes protéiques, elles peuvent avoir une spécificité différente et donc peuvent se cliver à des séquences consensuelles différentes.

Ces limites montrent qu’il ne suffit pas de se fier uniquement aux essais de clivage in vitro décrits dans ce protocole. D’autres approches devraient être utilisées pour valider davantage les résultats obtenus à l’aide de ce protocole. Idéalement, des essais in vivo devraient être utilisés pour répondre aux questions suivantes : La protéine candidate est-elle traitée protéolytiquement au cours du processus non apoptotique in vivo? Dans l’affirmative, le même site de clivage est-il utilisé in vivo et in vitro? Quelle est la conséquence si le clivage est bloqué par mutagénèse du site de clivage ? Le traitement du substrat candidat dépend-il des caspases et, dans l’affirmative, lesquelles? Quel est le rôle des fragments de clivage pour le processus non apoptotique? Ces questions peuvent être facilement abordées dans les organismes modèles génétiques tels que C. elegans et Drosophila en utilisant des méthodes génétiques et transgéniques standard.

En résumé, ce protocole décrit une méthode fiable et cohérente pour produire des caspases enzymatiquement actives, en particulier les caspases Dronc et Drice . Le but ultime de ce protocole est d’examiner si Dronc peut cliver des substrats candidats in vitro, qui ont été identifiés par des approches génétiques, biochimiques ou bioinformatiques. Comme expliqué dans le paragraphe précédent, des tests supplémentaires sont nécessaires pour valider ces protéines en tant que substrats de caspases in vivo. Compte tenu du degré de conservation des gènes des caspases à travers les métazoaires, il devrait être possible d’adapter ce protocole aux caspases d’autres organismes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier la Dre Elif Kamber-Kaya pour son aide dans l’établissement du protocole en laboratoire. Le Dr Guy Salvesen a aimablement fourni le mutantDrice C211A 9. Ce travail a été financé par une bourse MIRA de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS) des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de subvention 2R35GM118330. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Materials

Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001
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References

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Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).
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