في المختبر مقايسات الانقسام باستخدام كاسباز ذبابة الفاكهة المؤتلف المنقى لفحص الركيزة
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن ذبابة الفاكهة المؤتلفة وتنقيتها ، واستخدامها في فحوصات الانقسام في المختبر .
Abstract
Caspases هي بروتياز موت الخلايا محددة للغاية تشارك في عمليات موت الخلايا المبرمج وغير موت الخلايا المبرمج. في حين أن دور الكاسباز أثناء موت الخلايا المبرمج قد تم تحديده جيدا وتم تحديد وتوصيف العديد من ركائز التحلل البروتيني المبرمج للكاسباز ، فإن دور الكاسباز في العمليات غير المبرمج غير مفهوم جيدا. على وجه الخصوص ، تم تحديد عدد قليل من ركائز غير موت الخلايا المبرمج من caspases حتى الآن. هنا ، من أجل تسهيل تحديد وتوصيف ركائز caspase المحتملة ، يتم وصف بروتوكول يسمح باختبار الركائز المرشحة في مقايسات انقسام caspase في المختبر . يتضمن هذا البروتوكول إنتاج وتنقية بروتينات الكاسباز المؤتلفة ، وإنتاج الركائز المرشحة إما بشكل مؤتلف أو في نظام تعبير خال من الخلايا ، وتفاعل الانقسام الفعلي في المختبر متبوعا ب SDS-PAGE و immunoblotting. تم تصميم هذا البروتوكول لذبابة الفاكهة كاسباس درونك ودريس ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع كاسباز من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك الثدييات.
Introduction
يتم تنفيذ موت الخلايا المبرمج أو موت الخلايا المبرمج بواسطة فئة من بروتياز موت الخلايا عالية التخصص تسمى كاسباز (تمت مراجعتها في المرجع1). Caspases هي بروتياز Cys تحتوي على بقايا Cys في الموقع الحفاز. لقد حددوا مواقع الانقسام التوافقي والركائز المشقوقة بروتينيا بعد بقايا Asp (على الرغم من أنه تم الإبلاغ أيضا عن أن ذبابة الفاكهة caspase Dronc قد تم الإبلاغ عنها أيضا للالتصاق بعد بقايا Glu2). وهي مقسمة إلى بادئ (يعرف أيضا باسم القمي أو المنبع) والمستجيب (الجلاد أو المصب) كاسباس. كاسباس البادئ تنشيط كاسباس المستجيب. على سبيل المثال ، في الثدييات ، يشق البادئ caspase Caspase-9 وينشط المستجيب caspase Caspase-33. وبالمثل ، في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، يشق كاسباس-9-أورثولوج درونك وينشط كاسباس-3-أورثولوج دريس 2,4. أثناء موت الخلايا المبرمج ، تشق كاسباس المستجيب مئات الركائز مما يؤدي إلى موت الخلية5.
يتم تصنيع Caspases كإنزيمات غير نشطة (zymogens) في الخلية. في هذا الشكل ، تحتوي على مجال N-terminal ، ووحدة فرعية كبيرة مع Cys الحفاز في الجزء المركزي من الإنزيم ، ووحدة فرعية صغيرة في C-terminus 1 (الشكل 1). تختلف آلية التنشيط بين البادئ والمستجيب. يتطلب كاسباس البادئ (Caspase-9 ، Dronc) dimerization للتنشيط ، والذي يحدث عن طريق الاندماج في مركب بروتين كبير ، يسمى apoptosome6. للدمج في apoptosome ، يحمل Caspase-9 و Dronc مجال تنشيط وتوظيف caspase (CARD) في المجال prodomain N-terminal (الشكل 1). يحتوي المكون apoptosome Apaf-1 أيضا على CARD ويجند Caspase-9 أو Dronc عبر تفاعل CARD / CARD في apoptosome3،6،7. بينما يمكن معالجة Caspase-9 و Dronc بروتينا في apoptosome ، فإن هذه المعالجة ليست مطلوبة بالكامل للنشاط الأنزيمي 8,9.
في المقابل ، لا تحمل كاسباس المستجيب (Caspase-3 ، Drice) بطاقة في نطاقاتها ولا يتم دمجها في مجمعات البروتين الكبيرة للتنشيط1. وهي تعتمد على الانقسام المحلل للبروتين بواسطة Caspase-9 أو Dronc1 النشط ، على التوالي. يشكل المستجيب النشط كاسباز رباعيا يتكون من وحدتين فرعيتين كبيرتين ووحدتين فرعيتين صغيرتين ، وبالتالي يحتوي على موقعين حفازين (الشكل 1). الأهم من ذلك بالنسبة لهذا البروتوكول ، أن التعبير المؤتلف عن الكاسباس في الإشريكية القولونية يسبب المعالجة التلقائية وتنشيط الكاسباز ، بما في ذلك Drice10 و Dronc2،8،9،11،12 ، حتى في حالة عدم وجود Apaf-1. تسمح هذه المعالجة التلقائية بإجراء فحوصات الانقسام في المختبر للركائز المرشحة مع بروتين كاسباز المؤتلف.
لا تشارك Caspases فقط في موت الخلايا المبرمج ، ولكن يمكن أن يكون لها أيضا العديد من الوظائف غير المبرمج ، بما في ذلك الانتشار ، والتمايز ، وهجرة الخلايا ، وتقليم الخلايا العصبية ، والمناعة الفطرية ، وغيرها 13،14،15. من غير المعروف حاليا كيف يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة على الرغم من احتوائها على كاسباس نشط أثناء العمليات غير المبرمجة. من الممكن أن تقوم هذه الخلايا بتنشيط caspases فقط عند المستويات شبه المميتة16 أو أنها تعزل caspases النشطة في مقصورات غير موت الخلايا المبرمج للخلية مثل غشاء البلازما17,18. لذلك ، فإن تحديد الركائز غير المبرمج والتحقق منها لن يكشف فقط كيف تتوسط الكاسباس في العمليات غير المبرمج ، بل قد يساعد أيضا في فهم كيف يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة في وجود كاسباس نشط.
يمكن تحديد البروتينات المرشحة كركائز كاسباز باستخدام الطرق الوراثية والكيميائية الحيوية. يمكن التحقق من البروتينات المحددة لوجود مواقع انقسام Dronc الإجماعية. يمكن القيام بذلك عن طريق فحص تسلسل البروتين بصريا أو استخدام أدوات معلوماتية حيوية أكثر تطورا عبر الإنترنت مثل CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19،20. تستخدم هذه الأدوات مواقع الانقسام التوافقية المعروفة للكاسباس والاعتبارات الهيكلية للتنبؤ بأهداف جديدة للكاسباز. بينما يتضمن CasCleave معلومات الركائز التي تم التحقق منها من Caspases-1 و -3 و -6 و -7 و -8 ، فقد يكون مفيدا أيضا للأغراض الموضحة هنا حيث يتم الحفاظ على هذه الكاسباس ومواقع الانقسام التوافقية الخاصة بها بشكل جيد. ومع ذلك ، نظرا لأن موقع انقسام Dronc غير محدد جيدا (حددت دراستان موقعين مختلفين للانقسام الأمثل ، TATD / E2 و LALD9) ، يتم فحص الركائز المرشحة أيضا لوجود موقع انقسام caspase آخر ، بما في ذلك Drice.
للتحقق من صحة الركائز المتوقعة من caspases ، من الضروري إجراء فحوصات إضافية. أحد هذه المقايسات هو إثبات أن كاسباز معين يمكن أن يشق البروتين المرشح في المختبر. هنا ، نقدم بروتوكولا مناسبا لفحوصات الانقسام في المختبر . باستخدام هذا البروتوكول ، يتم اختبار الركائز المرشحة باستخدام Dronc مثل caspase. يمكن أيضا اختبارها كركائز من Drice. على الرغم من أن هذا البروتوكول مكتوب لذبابة الفاكهة caspases Dronc و Drice ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفه مع caspases من الكائنات الحية الأخرى.
يجب إجراء استخراج وتنقية Dronc و Drice جنبا إلى جنب مع فحص الانقسام في المختبر في نفس اليوم بسبب فقدان النشاط الحفاز بواسطة هذه الكاسباس. تم تعديل هذا البروتوكول وتحسينه من المنشورات السابقة8،9،11،12،21،22. في هذا البروتوكول ، يتم التعبير عن أربعة بروتينات كاسباز مختلفة بشكل مؤتلف في سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) pLysS. هذه البروتينات هي: 6xHis-Dronc بالوزن ، 6xHis-DroncC318A ، 6xHis-Driceبالوزن ، و 6xHis-DriceC211A. يتم تمييز كل من هذه البروتينات ب 6 بقايا هستيدين (6xHis) في المحطة N للتنقية. Dronc wt و Dricewt هما بروتينات من النوع البري ويمكنهما المعالجة التلقائية في الكاسباز النشط عند التعبير المؤتلف. يقوم DroncC318A و DriceC211A بتشفير أشكال متحولة من Dronc و Drice التي تغير بقايا Cys التحفيزية إلى بقايا Ala. هذه التركيبات غير نشطة تحفيزيا ولا يمكنها المعالجة التلقائية (انظر الشكل 2 أ). يتم استخدامها كضوابط في فحص الانقسام. نظرا لأن DriceC211A لا يمكنه المعالجة التلقائية ، فإنه يستخدم أيضا كركيزة نموذجية ل Droncwt في مقايسة الانقسام في المختبر الموضحة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اشتقاق الجزء الأكبر من معرفتنا حول وظيفة الكاسباز والكاسباز من العمل المكثف في موت الخلايا المبرمج خلال العقود الثلاثة الماضية. من الثابت جدا أن كاسباس البادئ يعالج كاسباس المستجيب بروتينيا ، وقد تم تحديد مئات البروتينات على أنها ركائز كاسباز المستجيب أثناء موت الخلايا المبرمج 5,29. في المقابل ، لا يعرف الكثير عن وظيفة caspases للعمليات غير المبرمج والركائز غير المبرمج التي يعالجونها. من المتصور أن يكون كاسباس البادئ من صناع القرار الرئيسيين هنا. أثناء موت الخلايا المبرمج ، فإنها تنشط كاسباس المستجيب مما يسبب موت الخلايا. ومع ذلك ، لتحفيز عمليات غير موت الخلايا المبرمج ، فإنها قد تنشط بروتينات مختلفة (بخلاف كاسباس المستجيب) ، والتي تتحكم في العملية غير المبرمجة. يختبر هذا البروتوكول البروتينات المرشحة كركائز من البادئ caspase Dronc في ذبابة الفاكهة 17,30.
يمكن إنتاج الركائز المراد اختبارها في مقايسة الانقسام إما في نظام تعبير خال من الخلايا في الثدييات في المختبر مثل RRL أو عن طريق التعبير المؤتلف في الإشريكية القولونية. هناك العديد من المزايا للتعبير في المختبر باستخدام RRL على التعبير البكتيري. بروتوكول التعبير RRL بسيط وسريع ، مما يسمح بإعداد العديد من الركائز المختلفة بالتوازي. في كثير من الحالات ، يمكن تخزين مستخلص RRL الذي يحتوي على البروتين محل الاهتمام عند -80 درجة مئوية قبل استخدامه في مقايسة الانقسام (على الرغم من أن هذا يحتاج إلى تحديد منفصل لكل ركيزة). يمكن تسمية الركيزة المفترضة ب S35-Met ، مما يسمح بالتحليل السهل عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي بعد SDS-PAGE. هذا مفيد بشكل خاص ، إذا لم يكن هناك جسم مضاد خاص بالركيزة. بدلا من ذلك ، إذا لم يكن وضع العلامات S35-Met مرغوبا فيه ، فيمكن تمييز الركيزة المفترضة بعلامات شائعة مثل علامات Flag أو HA أو Myc ، مما يسمح باكتشاف انشقاق caspase عن طريق النشاف المناعي.
يجب التأكيد بقوة على أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد على التنقية الدقيقة والمتسقة لبروتينات Dronc و Drice المؤتلفة. لسوء الحظ ، لا يمكن تخزين هذه البروتينات – ولا حتى على المدى القصير – لا في الثلاجة ولا تجميدها. يفقدون النشاط الأنزيمي بين عشية وضحاها في أي شكل مخزن. لذلك ، يجب أن يكونوا مستعدين طازجا في يوم فحص الانقسام. بغض النظر عن البروتين (البروتينات) المرشح الذي يتم اختباره ، يجب دائما استخدام DriceC211A كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من النشاط الأنزيمي لإعداد Droncwt (انظر الشكل 2B ، C). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا اختبار نشاط مستحضرات Dronc و Drice عن طريق الانقسام في المختبر لركائز رباعي الببتيد الاصطناعية الفلورية2،9،31.
إذا تم استخدام الأجسام المضادة للكشف عن الركائز المرشحة ، فيجب التحقق من صحتها من قبل المستخدم32,33. ينطبق ذلك أيضا على الأجسام المضادة المتاحة تجاريا والتي تكتشف علامات epitope مثل Flag أو HA أو Myc أو غيرها. يمكن أن تحجب جودة الأجسام المضادة الرديئة النتائج المهمة. يوصى أيضا بوضع علامات مزدوجة على الركائز المرشحة على كل من N- و C-terminus بعلامات مختلفة34. في حالة حدوث الانقسام ، يساعد وضع العلامات المزدوجة على تتبع كل من منتجات الانقسام وقد يساعد في توضيح ما إذا كان الانقسام يحدث في موقع واحد أو أكثر.
في حين أن هذا البروتوكول يتحقق بسهولة من صحة الركيزة البيولوجية المعروفة ل Dronc ، Drice ، إلا أن هناك أيضا قيودا. أحد القيود هو أن هذا بروتوكول في المختبر مع البروتينات المؤتلفة. في هذه المقايسات ، توجد الكاسباز بتركيز عال غير فسيولوجي ، وهو ما يتضح من ملاحظة أنه يمكنهم المعالجة التلقائية تلقائيا في الإشريكية القولونية. عادة لا تحدث المعالجة التلقائية التلقائية في ظل الظروف الفسيولوجية. قد يتسبب تركيز الكاسباز العالي هذا في نشاط زائف يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. يمكن القضاء على الإيجابيات الكاذبة عن طريق خفض تركيز الكاسباز في تفاعل الانقسام في المختبر . علاوة على ذلك ، كما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه ، من الضروري إجراء فحوصات إضافية لتأكيد الركائز الأصلية والقضاء على الإيجابيات الخاطئة.
قد لا يكون للكاسباز المؤتلف نفس الخصوصية التي تتمتع بها في بيئتها الخلوية الطبيعية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن تعديل نشاط caspases عن طريق تعديلات ما بعد الترجمة. هذه غير موجودة على البروتينات المؤتلفة. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، يتم دمج كاسباس البادئ ، بما في ذلك Dronc في مجمعات بروتينية كبيرة مثل apoptosome. في ظل ظروف هذا البروتوكول ، لا يتحقق تشكيل apoptosome. سيتطلب ذلك تعبيرا مؤتلفا عن ذبابة الفاكهة Apaf-1 (المعروفة أيضا باسم Dark أو Hac-1) 35-37 التي تواجه تحديات خاصة بها. لذلك ، في المختبر ، قد لا يكون ل Dronc نفس الخصوصية التي يتمتع بها في الجسم الحي.
من المتصور أيضا أن يتم دمج Dronc في مركب بروتيني مختلف للعمليات غير المبرمجة. قد يمنح هذا خصوصية انقسام مختلفة ل Dronc ، مما قد يفسر أيضا سبب عدم تحفيز Dronc لموت الخلايا المبرمج في ظل ظروف غير موت الخلايا المبرمج. فيما يتعلق بهذا ، يستخدم CasCleave مواقع إجماع الانقسام المعروفة للتنبؤ بركائز كاسباز جديدة. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كانت نفس مواقع إجماع الانقسام تستخدم أيضا في العمليات غير المبرمجة. في الواقع ، في الآونة الأخيرة ، تبين أن Caspase-3 يغير موقع الإجماع المفضل لديه خلال عملية غير موت الخلايا المبرمج في جذع الدماغ السمعي النامي في جنين الفرخ38. وبالمثل ، إذا تم دمج كاسباس البادئ في مجمعات بروتينية مختلفة ، فقد يكون لها خصوصية مختلفة وبالتالي قد تلتصق بتسلسلات إجماع مختلفة.
توضح هذه القيود أنه لا يكفي الاعتماد فقط على مقايسات الانقسام في المختبر الموصوفة في هذا البروتوكول . يجب استخدام نهج بديلة لزيادة التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. من الناحية المثالية ، يجب استخدام المقايسات في الجسم الحي لمعالجة الأسئلة التالية: هل تتم معالجة البروتين المرشح بروتينيا أثناء العملية غير المبرمج في الجسم الحي؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهل يتم استخدام نفس موقع الانقسام في الجسم الحي وفي المختبر؟ ما هي النتيجة إذا تم حظر الانقسام عن طريق الطفرات في موقع الانقسام؟ هل تعتمد معالجة الركيزة المرشحة على الكاسباس ، وإذا كان الأمر كذلك ، فأي واحد؟ ما هو دور شظايا الانقسام في العملية غير المبرمجة؟ يمكن معالجة هذه الأسئلة بسهولة في الكائنات النموذجية الجينية مثل C. elegans و Drosophila باستخدام الطرق الجينية والمحورة وراثيا القياسية.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومتسقة لإنتاج كاسباس نشط إنزيميا ، وتحديدا كاسباس ذبابة الفاكهة درونك ودريس. الهدف النهائي من هذا البروتوكول هو فحص ما إذا كان Dronc يمكنه شق الركائز المرشحة في المختبر ، والتي تم تحديدها من خلال مناهج الجينات أو الكيمياء الحيوية أو المعلوماتية الحيوية. كما هو موضح في الفقرة السابقة ، هناك حاجة إلى فحوصات إضافية للتحقق من صحة هذه البروتينات كركائز كاسباز في الجسم الحي. بالنظر إلى درجة حفظ جينات الكاسباز عبر الميتازوا ، يجب أن يكون من الممكن تكييف هذا البروتوكول مع الكاسباز من الكائنات الحية الأخرى أيضا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة إليف كامبر كايا على مساعدتها في وضع البروتوكول في المختبر. قدم الدكتور جاي سالفيسن متحولة DriceC211A 9. تم تمويل هذا العمل من خلال جائزة MIRA من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب المنحة رقم 2R35GM118330. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 | |
References
- Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
- Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
- Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
- Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
- Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
- Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
- Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
- Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
- Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
- Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
- Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
- Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
- Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
- Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
- Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
- Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
- Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
- Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
- Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
- Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
- Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
- Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
- Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).
