ランゲンドルフモデルにおける Ex vivo マウス両心室機能の評価

このプロトコルのすべての動物実験は、ミシガン大学アナーバー校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべてのマウスを病原体のない部屋に12:12の光サイクルで収容しました。このプロトコルで使用されるすべての材料、動物、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。 1. シリコンバルーンカテーテルの製作 注:シリコンバルーンは、前述のように作られています13. 100 mLのビーカーに、9.5 mLの蒸留水、14.2 mLのライトコーンシロップ、33.8 gのスクロースを加えます。砂糖が完全に溶けるまで溶液を加熱してかき混ぜます。 小麦粉10gと水5gを均一になるまで混ぜて生地を準備し、10分間休ませます。 生地の小片を楕円形の「頭」に成形し、乾燥したスパゲッティストランドの端に取り付けます。次に、このヘッドを砂糖溶液に浸し、ヘッドが完全にコーティングされたので、溶液からゆっくりと取り出します。注意: 生地は滑らかで均一な食感でなければなりません。生地のサイズを変えて、5 mm(短径)から7 mm(長径)まで、さまざまなサイズのバルーンを生成できます。砂糖溶液の薄膜で覆ってみてください。 スパゲッティストランドを発泡スチロールブロックまたは他のホルダーに吊り下げて、頭の上に光沢のあるカバーを均等に形成し、一晩乾かします。 金型をシリコーン分散液(キシレンに分散したシリコーンエラストマー)に浸します。スパゲッティストランドを発泡スチロールブロックに戻し、37°Cで2時間、または乾くまで加熱します。この手順を 1 回繰り返します。注:シリコーン分散ゲルは、バルーンの厚さが不均一になるため、空気にさらされることによる酸化を防ぐことが不可欠です。 型を水に入れてバルーンを分離して集めます。バルーンを0.02%アジ化ナトリウムで保管します。 22Gの針から2つの鈍い先端を切り取ります。一方の鈍い端をシリコンバルーンに取り付け、もう一方の鈍い端をPEチューブに取り付けます。4-0シルクを使用して、バルーンを針の所定の位置に結びます。注意: バルーンに水を注入して、バルーンの完全性をテストします。バルーンがいっぱいになったら、バルーンをそっと押して、バルーンが内部で張力を維持しているかどうかをテストします。漏れている場合は、新しいバルーンを使用してください。取り付けられたバルーンは、将来の使用のために保管できます。 2.心臓灌流システムの準備 1 LのKrebs-Henseleit(KH)灌流バッファーを作成し、貯水槽Langendorffシステムに移します。 エアチューブを貯水槽に接続し、気流をオンにして、KHバッファーを5%CO2および95%O2と少なくとも30分間バランスさせます。 ウォーターバスを41.5°Cに設定し、ランゲンドルフシステムの外層に水を循環させて、システムとKHバッファーを温めます。注:ウォーターバスの温度は、システムごとに最適化する必要があります。このシステムでは、心臓に灌流するときに、ウォーターバスの温度はKHを37〜37.5°Cに維持します。 3. マウス心臓の単離、取り付け、カニューレ挿入 抗凝固療法のために、C57 / B6マウス腹部の右側象限に腹腔内(i.p.)注射により、生理食塩水中のヘパリン200単位を投与します。注射前にシリンジを吸引して、針の斜角が消化管の膀胱または内腔にないことを確認します。.各実験条件で少なくとも4匹のマウスを使用します(ただし、処理効果の大きさも考慮してください)。30分後、80 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンi.p.を投与してマウスに麻酔をかけます。.麻酔をかけられたマウスが意識を失っていないか、つま先をつまんで反応がないことを確認します。アセプロマジン2mg / kgは、使用されたマウス株がket / xylのみで適切なレベルの麻酔に達しない場合、ket / xylカクテルに追加できます。. 胸骨の真下を切開します。はさみを使って横隔膜と肋骨を切って胸を開きます。胸壁前部を折りたたんで、胸部を完全に露出させます。下行大動脈(大動脈弓まで閉じている)を切断します。マウスの心臓、肺、胸腺を冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸(HTK)緩衝液に移します。氷冷HTKバッファー下で臓器を単離します。結合組織を除去して大動脈を露出させます。注:上行大動脈と大動脈弓領域の両方を切除に含めて、針に接続するのに十分なスペースを確保することにより、大動脈の長さを最大化します。 大動脈の端を22Gの針に接続し、6-0シルク縫合糸で結びます。カニューレが大動脈根の上にあることを確認して、大動脈弁に干渉しないようにします。10 mLの低温(4°C)HTKバッファーで大動脈を約10分間灌流します。注:心臓の除去から大動脈のカニューレ挿入まで15分もかかりません。ただし、灌流速度を適切なレベルに保つことが重要です。速すぎて激しい注射は、高圧を発生させ、血管/心臓の損傷を引き起こす可能性があります。 心臓を氷冷HTKを含む50 mLチューブに8時間保存するか、直ちに灌流を行い(コントロールは保管しないでください)、氷との直接接触を避けてください。注意: 心臓組織を氷に直接接触させると、寒さによる怪我につながる可能性があります。 針に取り付けられた心臓をランゲンドルフ装置のカニューレに接続し、絹の縫合糸で結びます。注:手順を標準化するには、灌流前にカニューレ挿入プロセスを合計3分間待ちます。 3 mL/分で定流量モードで灌流を開始します。次に、70〜80 mmHgで定圧モードに変更し、心臓を~6 mL / minに調整します。注:心臓をそっと触診すると、心臓の蘇生を早めることができます。定圧モードで灌流流量が6 mL / minをはるかに超えている場合は、カニューレ挿入に漏れがあるか、大動脈弁が正常に機能していない可能性があります。接続を調整して漏れを修正します。コンスタントフローモードは、心臓の血管緊張の自己調整を上書きします。定圧モードにより、心臓は冠状動脈灌流の流れを調節することができます。したがって、定圧モードは、心臓の機能と心臓の保存品質を正確に測定します。 空気を抜いて水で満たされたバルーンを、圧力トランスデューサと水で満たされたシリンジに三方タップで接続します。15〜20分の平衡化期間の後、右心房(RA)を切断し、RAを介してバルーンをRVに挿入します。テープを使用してバルーンを RV 内に保持します。 RA の開口領域を最小限にして、バルーンを心室に拘束します(セットアップについては 図 1 を参照)。注:心臓の収縮と弛緩は最初は安定しておらず、測定値は正確で代表的ではないため、平衡化の期間が必要です。.関節リウマチの開室中にAVリンパ節が損傷すると、心臓は頻繁な不整脈を示します。 RV機能データ収集の20分後、左心房(LA)を切断し、LAを介して収縮した水で満たされたバルーンをLVに挿入します。テープを使用してバルーンをLV内に保持します。注意: 心臓は1.5時間以上安定した血行動態を維持する必要があります。 4.機能データ記録 圧力トランスデューサの校正10 mLのシリンジに温かい生理食塩水を入れ、シリンジを三方タップでドームに接続します。蛇口を開き、ドームをゆっくりと生理食塩水で満たしてから、すべての蛇口を閉じてシリンジを取り外します。充填されたドームをトランスデューサーに取り付けます。圧力計を三方タップの3番目の端に接続します。 録音ソフトウェアで、トランスデューサーに接続しているチャンネルのドロップダウンメニューから ブリッジアンプ を選択します。 チャネル の名前を 「Perfused pressure」に変更します。[ゼロ]をクリックして、トランスデューサを ゼロ にします。 [開始]をクリックして記録を開始し、トランスデューサーが0mmHgを読み取るようにします。数秒記録した後、シリンジをゆっくりと押し、圧力を100に上げます。[停止] をクリックして記録を停止します。 [単位変換]ダイアログで、0 mmHg の記録領域を選択し、[ポイント 1]の矢印をクリックして 0 mmHg と入力します。100 mmHgの記録領域を選択し、ポイント2への矢印をクリックして、100 mmHgと入力します。[OK]をクリックして、トランスデューサを校正します。 バルーンのある圧力トランスデューサに対応するチャンネルの名前を 「Ventricle pressure」に変更します。心臓がシステムに接続されると、記録を開始します。バルーンを心室に挿入した後、三方タップを介してマイクロメーターシリンジを使用してバルーン内の 水量 を調整し、 拡張末期血圧 を 5〜10 mmHgに維持します。.注:拡張末期の測定値は、測定中に減少する可能性があり、できれば10 mmHg近くから開始します。 空のチャネルの名前を dP/dt に変更します。ドロップダウンメニューから、Derivative | source channelをVentricle Pressureとして選択します。チャネルは、収縮期間中の心室腔内の圧力変化の比率を記録します。 安定した測定期間を選択し、血圧モジュールの[設定]をクリックします。入力チャネルとして心室圧を選択し、計算期間の選択をクリックします |[OK]をクリックします。 Classifier viewをクリックして、外れ値の心周期(例:異常なサイクルタイムや圧力)を削除します。 テーブル ビュー をクリックして、選択した期間の最大dP/dt(収縮)と最小dP/dt(緩和)の平均のテーブルを生成します。注:記録を保存してください file 各サンプルのファイルと、統計分析のために平均心機能の表を保存します。