Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model

Alle dierproeven in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Michigan, Ann Arbor. Alle muizen werden gehuisvest in een lichtcyclus van 12:12 in pathogeenvrije kamers. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, dieren en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. 1. Constructie van de siliconenballonkatheter OPMERKING: De siliconenballon is gemaakt zoals eerder beschreven13. Voeg 9,5 ml gedestilleerd water, 14,2 ml lichte glucosestroop en 33,8 g sacharose toe aan een bekerglas van 100 ml. Verwarm en roer de oplossing tot de suiker volledig is opgelost. Bereid het deeg voor door 10 g tarwebloem en 5 g water te mengen tot een gelijkmatige consistentie is bereikt en laat het 10 minuten rusten. Vorm een klein stukje deeg tot een ovaal – de “kop” – en bevestig het aan het uiteinde van een droge spaghettistreng. Dompel deze kop vervolgens in de suikeroplossing en haal hem langzaam uit de oplossing, aangezien de kop nu volledig bedekt is.NOTITIE: Het deeg moet glad en gelijkmatig van structuur zijn. De grootte van het deeg kan worden gevarieerd om ballonnen van verschillende grootte te genereren, van 5 mm (korte diameter) tot 7 mm (lange diameter). Probeer ze te bedekken met een dun laagje suikeroplossing. Hang de spaghettistreng op een blok polystyreenschuim of andere houders, om een glanzende hoes gelijkmatig over het hoofd te vormen en een nacht te drogen. Dompel de mal in siliconendispersie (siliconenelastomeer gedispergeerd in xyleen). Plaats de spaghettistreng terug in het polystyreenschuimblok bij 37 °C gedurende 2 uur of tot het droog is. Herhaal deze stap één keer.NOTITIE: Het is essentieel om te voorkomen dat de siliconendispersiegel oxideert door blootstelling aan de lucht, omdat dit een ongelijkmatige ballondikte genereert. Plaats de mal in het water om de ballon te scheiden en op te vangen. Bewaar de ballon in 0,02% natriumazide. Knip een punt met twee stompe uiteinden van een naald van 22 G; monteer een stomp uiteinde op de siliconenballon en een ander stomp uiteinde op PE-slang. Gebruik 4-0 zijde om de ballon op zijn plaats op de naald te binden.NOTITIE: Test de integriteit van de ballon door er water in te injecteren. Zodra de ballon gevuld is, drukt u zachtjes op de ballon om te testen of de ballon de spanning binnenin behoudt. Gebruik een nieuwe ballon als deze lekt. De gemonteerde ballonnen kunnen worden opgeborgen voor toekomstig gebruik. 2. Voorbereiding van het hartperfusiesysteem Maak 1 L Krebs-Henseleit (KH) perfusiebuffer en breng deze over naar het waterreservoir Langendorff-systeem. Sluit de luchtslang aan op het waterreservoir en schakel de luchtstroom in om de KH-buffer met 5% CO 2 en 95% O2 gedurende minimaal 30 minuten in evenwicht te brengen. Stel het waterbad in op 41,5 °C en laat het water in de buitenste laag van het Langendorff-systeem circuleren om het systeem en de KH-buffer op te warmen.NOTITIE: De temperatuur van het waterbad moet voor elk systeem worden geoptimaliseerd. Voor dit systeem zal de temperatuur van het waterbad de KH op 37-37,5 °C houden bij perfusie in het hart. 3. Isolatie, montage en canulatie van het muizenhart Voor antistolling, toediening 200 eenheden heparine in zoutoplossing door intraperitoneale (i.p.) injectie in het rechterkwadrant van C57/B6 muizenbuik. Zuig de spuit vóór de injectie op om te bevestigen dat de afschuining van de naalden zich niet in de blaas of het lumen van het maagdarmkanaal bevindt. Gebruik ten minste vier muizen in elke experimentele conditie (maar houd ook rekening met de grootte van het behandelingseffect).Dien na 30 minuten 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine i.p. toe om de muis te verdoven. Controleer of de verdoofde muis bewusteloos is door een teenknijp uit te voeren en ervoor te zorgen dat er geen reactie wordt waargenomen. Acepromazine 2 mg/kg kan aan de ket/xyl-cocktail worden toegevoegd als de gebruikte muizenstam geen adequaat niveau van anesthesie bereikt met alleen ket/xyl. Maak een incisie net onder het borstbeen. Gebruik een schaar om de borstkas te openen door het middenrif en de ribben door te knippen. Vouw de voorste borstwand om de borstkas volledig bloot te leggen. Snijd bij de dalende aorta (gesloten tot aan de aortaboog). Breng het hart, de longen en de thymus van de muis over naar koude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK)-buffer. Isoleer de organen onder ijskoude HTK-buffer. Leg de aorta bloot door eventueel bindweefsel te verwijderen.NOTITIE: Maximaliseer de lengte van de aorta door zowel de aorta ascendens als de aortaboog in de excisie op te nemen, zodat er voldoende ruimte is om verbinding te maken met een naald. Sluit het uiteinde van de aorta aan op een naald van 22 G en bind vast met een 6-0 zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de canule zich boven de aortawortel bevindt om de aortaklep niet te hinderen. Doordrenk de aorta met 10 ml koude (4 °C) HTK-buffer gedurende ongeveer 10 minuten.OPMERKING: Het duurt minder dan 15 minuten vanaf het verwijderen van het hart tot het canuleren van de aorta; Het is echter belangrijk om de perfusiesnelheid op het juiste niveau te houden. Injecties die te snel en krachtig zijn, kunnen hoge druk veroorzaken en vasculaire/hartschade veroorzaken. Bewaar het hart gedurende 8 uur in een buisje van 50 ml met ijskoude HTK of voer onmiddellijk de perfusie uit (bewaar de controle niet) en vermijd direct contact met ijs.NOTITIE: Direct contact van het hartweefsel met ijs kan leiden tot koudeletsel. Verbind het met de naald gemonteerde hart met de canule in het Langendorff-apparaat en bind het vast met een zijden hechtdraad.NOTITIE: Om de procedure te standaardiseren, wacht u in totaal 3 minuten op het canulatieproces vóór perfusie. Start de perfusie met een constante stroommodus van 3 ml/min; schakel vervolgens over naar de constante drukmodus bij 70-80 mmHg en stel het hart in op ~6 ml/min.OPMERKING: Het zacht palperen van het hart kan de hartreanimatie helpen versnellen. Als het perfusiedebiet veel hoger is dan 6 ml/min bij constante druk, kan er een lek in de canulatie zijn of werkt de aortaklep mogelijk niet goed. Pas de aansluitingen aan om het lek te verhelpen. De constante stroommodus heft de vasculaire tonuszelfregulatie van het hart op. De constante drukmodus stelt het hart in staat om de coronaire perfusiestroom te regelen. Daarom meet de constante drukmodus nauwkeurig de hartfunctie en de kwaliteit van het behoud van het hart. Sluit een leeggelopen, met water gevulde ballon aan op een druktransducer en een met water gevulde spuit met een driewegkraan. Na een evenwichtsperiode van 15-20 minuten, snijdt u het rechter atrium (RA) door en steekt u de ballon via de RA in de RV. Gebruik tape om de ballon in de camper te houden. Minimaliseer het open gebied van de RA om de ballon in het ventrikel te beperken (zie afbeelding 1 voor de opstelling).OPMERKING: Een periode van evenwicht is noodzakelijk, omdat de samentrekking en ontspanning van het hart in het begin niet stabiel zijn en de meting minder nauwkeurig en representatief is. Als de AV-knoop beschadigd raakt tijdens het openen van de RA, zal het hart frequente aritmieën vertonen. Na 20 minuten functionele verzameling van RV-gegevens, snijdt u het linker atrium (LA) door en steekt u een leeggelopen met water gevulde ballon door de LA naar de LV. Gebruik tape om de ballon in de LV te houden.OPMERKING: Het hart moet gedurende meer dan 1,5 uur een stabiele hemodynamica behouden. 4. Functionele gegevensregistratie Kalibratie van de drukopnemerVul een spuit van 10 ml met warme zoutoplossing en sluit de spuit aan op de koepel via een driewegkraan. Open de kraan en vul de koepel langzaam met zoutoplossing, en sluit vervolgens alle kranen en verwijder de spuit. Bevestig de gevulde koepel aan de transducer; Sluit de manometer aan op het derde uiteinde van de driewegkraan. Selecteer in de opnamesoftware de Bridge Amp in het vervolgkeuzemenu van het kanaal dat op de transducer is aangesloten. Wijzig de naam van het kanaal in Geperfuseerde druk. Klik op Nul om de transducer op nul te zetten. Start de opname door op Start te klikken, zodat de transducer nu 0 mmHg aangeeft. Na enkele seconden opnemen duwt u langzaam op de spuit en verhoogt u de druk tot 100. Klik op stop om de opname te stoppen. Selecteer in het dialoogvenster Eenheden conversie een opnamegebied voor 0 mmHg en klik op de pijl naar Punt 1 en typ 0 mmHg. Selecteer het opnamegebied voor 100 mmHg, klik op de pijl naar punt 2 en typ 100 mmHg. Klik op OK om de transducer te kalibreren. Wijzig de naam van het kanaal dat overeenkomt met de druktransducer met de ballon in Ventrikeldruk. Start de opname wanneer het hart is aangesloten op het systeem. Nadat u de ballon in het ventrikel hebt ingebracht, past u het watervolume in de ballon aan met behulp van een micrometerspuit door de driewegkraan om de einddiastolische druk op 5-10 mmHg te houden.OPMERKING: De einddiastolische maat kan tijdens de meting afnemen, bij voorkeur vanaf bijna 10 mmHg. Wijzig de naam van een leeg kanaal in dP/dt. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Derivaat | bronkanaal als Ventrikeldruk. Het kanaal registreert de verhouding van de drukverandering in de ventriculaire holte tijdens de contractieperiode. Selecteer een stabiele meetperiode en klik vervolgens op Instellingen in de module Bloeddruk.Selecteer de ventrikeldruk als ingangskanaal en klik op selectie voor een berekeningsperiode | Oké. Klik op Classificatieweergave om de uitschieter van de hartcyclus te verwijderen (bijvoorbeeld abnormale cyclustijd of druk). Klik op tabelweergave om de tabellen te genereren met het gemiddelde van max dP/dt (contractie) en min dP/dt (relaxatie) voor de geselecteerde periode.NOTITIE: Sla het opnamebestand voor elk monster op en sla de tabel met de gemiddelde hartfunctie op voor statistische analyse.