Summary

Un modello murino di intubazione orotracheale e chirurgia ventilata di ischemia polmonare riperfusione

Published: September 09, 2022
doi:

Summary

Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l’ipossia.

Abstract

Il danno da ischemia da riperfusione (IR) deriva frequentemente da processi che comportano un periodo transitorio di interruzione del flusso sanguigno. Nel polmone, l’IR isolata consente lo studio sperimentale di questo specifico processo con ventilazione alveolare continua, evitando così i processi dannosi composti di ipossia e atelettasia. Nel contesto clinico, il danno da ischemia da riperfusione polmonare (noto anche come IRI polmonare o LIRI) è causato da numerosi processi, inclusi ma non limitati a embolia polmonare, trauma emorragico rianimato e trapianto di polmone. Attualmente ci sono limitate opzioni di trattamento efficaci per LIRI. Qui, presentiamo un modello chirurgico reversibile di IR polmonare che coinvolge prima l’intubazione orotracheale seguita da ischemia unilaterale del polmone sinistro e riperfusione con ventilazione alveolare preservata o scambio gassoso. I topi subiscono una toracotomia sinistra, attraverso la quale l’arteria polmonare sinistra viene esposta, visualizzata, isolata e compressa utilizzando un nodo reversibile. L’incisione chirurgica viene quindi chiusa durante il periodo ischemico e l’animale viene risvegliato ed estubato. Con il topo che respira spontaneamente, la riperfusione viene stabilita rilasciando il nodo scivoloso attorno all’arteria polmonare. Questo modello di sopravvivenza clinicamente rilevante consente la valutazione del danno IR polmonare, della fase di risoluzione, degli effetti a valle sulla funzione polmonare, nonché di modelli a due colpi che coinvolgono la polmonite sperimentale. Sebbene tecnicamente impegnativo, questo modello può essere padroneggiato nel corso di poche settimane o mesi con un eventuale tasso di sopravvivenza o successo dell’80% -90%.

Introduction

La lesione da riperfusione ischemia (IR) può verificarsi quando il flusso sanguigno viene ripristinato in un organo o in un letto di tessuto dopo un certo periodo di interruzione. Nel polmone, l’IR può verificarsi isolatamente o in associazione con altri processi dannosi come infezione, ipossia, atelettasia, volutrauma (da alti volumi correnti durante la ventilazione meccanica), barotrauma (picchi elevati o pressioni sostenute durante la ventilazione meccanica) o contusioni polmonaricontundenti (non penetranti) 1,2,3 . Rimangono diverse lacune nella nostra conoscenza dei meccanismi di LIRI e dell’impatto dei processi concomitanti (ad esempio, infezione) sugli esiti LIRI, e anche le opzioni di trattamento per LIRI sono limitate. È necessario un modello in vivo di LIRI puro per identificare la fisiopatologia del danno IR polmonare in isolamento e per studiare il suo contributo a qualsiasi processo multi-hit di cui il danno polmonare è una componente.

I modelli IR polmonari murini possono essere utilizzati per studiare la fisiopatologia polmonare specifica di più processi, tra cui il trapianto polmonare3, l’embolia polmonare4 e la lesione polmonare a seguito di trauma emorragico con rianimazione5. I modelli attualmente utilizzati includono il trapianto polmonare chirurgico6, il clampaggio ilare7, la perfusione polmonare ex vivo 8 e il polmone ventilato IR9. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello IR polmonare ventilato murino di danno polmonare sterile. Ci sono molteplici vantaggi di questo approccio (Figura 2), tra cui che induce ipossia minima e atelettasia minima, ed è un modello di chirurgia di sopravvivenza che consente studi a lungo termine.

I motivi per scegliere questo modello di LIRI rispetto ad altri modelli come il clampaggio ilare e i modelli di perfusione ex vivo sono i seguenti: questo modello riduce al minimo i contributi infiammatori di atelettasia, ventilazione meccanica e ipossia; preserva la ventilazione ciclica; mantiene intatto un sistema immunitario circolatorio in vivo che può rispondere alla lesione IR; Infine, come procedura di sopravvivenza, consente l’analisi a lungo termine dei meccanismi di generazione di lesioni secondarie (modelli 2-hit) e risoluzione delle lesioni. Nel complesso, riteniamo che questo modello IR polmonare ventilato fornisca la forma “più pura” di lesione IR che possa essere studiata sperimentalmente.

Altre pubblicazioni hanno descritto l’uso dell’intubazione orotracheale dei topi per eseguire iniezioni o installazioni IT10,11, ma non come punto di partenza per un intervento chirurgico di sopravvivenza come in questo modello. Il posizionamento di un tubo orotracheale consente l’esecuzione della chirurgia polmonare consentendo il collasso del polmone operativo. Consente inoltre il regonfiamento del polmone alla fine della procedura, che è fondamentale per il pneumotorace e per la capacità del topo di tornare alla ventilazione spontanea al termine delle procedure. Infine, la rimozione del tubo orotracheale assicurato è una procedura semplice che, a differenza di una tracheotomia invasiva, è compatibile con un intervento chirurgico di sopravvivenza. Ciò consente studi di ricerca a lungo termine incentrati sulla comprensione della progressione e della risoluzione del LIRI e dei disturbi associati, nonché sulla creazione di modelli di lesioni croniche.

Protocol

Tutte le procedure e le fasi descritte di seguito sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) presso l’Università della California di San Francisco. È possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo, sebbene alcuni ceppi abbiano una risposta infiammatoria IR polmonare più robusta rispetto ad altri12. I topi che hanno circa 12-15 settimane di età (30-40 g) o più anziani tollerano e sopravvivono alla chirurgia IR polmonare meglio dei topi più giovani….

Representative Results

Infiammazione generata da lesione unilaterale ventilata da ischemia polmonare sterile (IR): dopo 1 ora di ischemia, abbiamo osservato un aumento dei livelli di citochine nel siero e all’interno del tessuto polmonare sia mediante ELISA che qRT-PCR che hanno raggiunto il picco a 1 ora dopo la riperfusione e sono tornati rapidamente al basale entro 12-24 ore dopo la riperfusione13. Per i campioni raccolti a 3 ore dopo la riperfusione, abbiamo osservato un’intensa infiltrazione di neutrofili all’inter…

Discussion

Questo manoscritto descrive in dettaglio i passaggi coinvolti nell’esecuzione del modello IR polmonare ventilato sviluppato da Dodd-o et al.9. Questo modello ha contribuito a identificare i percorsi molecolari coinvolti nella generazione e risoluzione dell’infiammazione da IR polmonare in isolamento 14,15,16,17, IR polmonare in combinazione con infezione coesistente 18 e IR polmonare in relazione all’asse intestino-polmone e al contributo del microbioma intestinale<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal supporto dipartimentale del Dipartimento di Anestesia e Cure Perioperatorie, dell’Università della California di San Francisco e del San Francisco General Hospital, nonché da un premio NIH R01 (ad AP): 1R01HL146753.

Materials

Equipment
Fiber Optic Light Pipe Cole-Parmer UX-41720-65 Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source AmScope SKU: CL-HL250-B Light source for fiberoptic lights
Germinator 500 Cell Point Scientific, Inc. No.5-1450 Bead Sterilizer
Heating Pad AIMS 14-370-223 Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) WAHL home products SKU 09854-600B To remove mouse hair on surgical site
Microscope Nikon SMZ-10 Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator Havard Apparatus Model 845 Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05 Clean tools that been used in operation
Warming Pad Kent Scientific RT-0501 To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale Cole-Parmer UX-11003-41 Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture Ethicon 683G For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture Ethicon Industry EP8734H Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) Aspen Surgical 372611 For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel Aspen Surgical 372612 For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps FST 11150-10 Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System FST 1. Base Plate (Nos. 18200-03)
2. Fixators (Nos. 18200-01)
3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12)
4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)
Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle COVIDIEN 05-561-20 For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps FST 11002-12 Skin level forceps
Needle holder/Needle driver FST 12565-14 for holding needles
Needles BD 305110 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps FST 00125-11 To hold PA; non-damaging gripper
Scissors FST 14060-09 Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps FST 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine Hospira, Inc. 0409-1159-02 Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine Covetrus North America 59122 Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant BAUSCH+LOMB Soothe Lubricant Eye Ointment Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution MEDLINE INDUSTRIES INC SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab BD brand  BD 326895 for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film KIRKLAND Stretch-Tite premium Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes Stoelting 50981 Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application Pwi-Wnaps 703033 used for applying eye lubricant
Top Sponges Dukal Corporaton Reorder # 5360 Stopping bleeding from skin/muscle

References

  1. Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
  2. Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
  3. Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
  4. Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
  5. Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
  6. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
  7. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  8. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  9. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
  10. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  11. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
  12. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
  13. Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
  14. Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
  15. Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
  16. Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
  17. Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
  18. Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
  19. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
  20. Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).

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Liao, W., Maruyama, D., Kianian, F., Tat, C., Tian, X., Hellman, J., Dodd-o, J. M., Prakash, A. A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery. J. Vis. Exp. (187), e64383, doi:10.3791/64383 (2022).

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