Summary

Ein Mausmodell der orotrachealen Intubation und der beatmeten Lungenischämie-Reperfusionschirurgie

Published: September 09, 2022
doi:

Summary

Ein chirurgisches Mausmodell zur Erzeugung einer Reperfusionsverletzung der linken Lunge (IR) bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Beatmung und Vermeidung von Hypoxie.

Abstract

Ischämie-Reperfusion (IR) -Verletzung resultiert häufig aus Prozessen, die eine vorübergehende Periode unterbrochenen Blutflusses beinhalten. In der Lunge ermöglicht die isolierte IR die experimentelle Untersuchung dieses spezifischen Prozesses mit fortgesetzter alveolärer Beatmung, wodurch die sich verstärkenden schädigenden Prozesse von Hypoxie und Atelektase vermieden werden. Im klinischen Kontext wird die Lungenischämie-Reperfusionsverletzung (auch bekannt als Lungen-IRI oder LIRI) durch zahlreiche Prozesse verursacht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lungenembolie, wiederbelebtes hämorrhagisches Trauma und Lungentransplantation. Derzeit gibt es nur begrenzte wirksame Behandlungsmöglichkeiten für LIRI. Hier präsentieren wir ein reversibles chirurgisches Modell der Lungen-IR mit erster orotrachealer Intubation, gefolgt von einseitiger linker Lungenischämie und Reperfusion mit konservierter Alveolarventilation oder Gasaustausch. Mäuse durchlaufen eine linke Thorakotomie, durch die die linke Lungenarterie freigelegt, visualisiert, isoliert und mit einem reversiblen Slipknot komprimiert wird. Der chirurgische Schnitt wird dann während der ischämischen Periode geschlossen und das Tier wird geweckt und extubiert. Wenn die Maus spontan atmet, wird die Reperfusion hergestellt, indem der Slipknot um die Lungenarterie gelöst wird. Dieses klinisch relevante Überlebensmodell erlaubt die Bewertung von Lungen-IR-Verletzungen, der Auflösungsphase, nachgeschalteten Effekten auf die Lungenfunktion sowie Zwei-Treffer-Modellen mit experimenteller Pneumonie. Obwohl dieses Modell technisch anspruchsvoll ist, kann es im Laufe von einigen Wochen bis Monaten mit einer Überlebens- oder Erfolgsrate von 80% -90% gemeistert werden.

Introduction

Ischämie-Reperfusion (IR) -Verletzung kann auftreten, wenn der Blutfluss zu einem Organ- oder Gewebebett nach einer gewissen Zeit der Unterbrechung wiederhergestellt wird. In der Lunge kann IR isoliert oder in Verbindung mit anderen schädlichen Prozessen wie Infektion, Hypoxie, Atelektase, Volutrauma (durch hohe Tidalvolumina während der mechanischen Beatmung), Barotrauma (hoher Spitzendruck oder anhaltender Druck während der mechanischen Beatmung) oder stumpfe (nicht penetrierende) Lungenprellung auftreten 1,2,3 . Es gibt noch einige Lücken in unserem Wissen über die Mechanismen von LIRI und die Auswirkungen gleichzeitiger Prozesse (z. B. Infektion) auf LIRI-Ergebnisse, und auch die Behandlungsmöglichkeiten für LIRI sind begrenzt. Ein In-vivo-Modell der reinen LIRI ist erforderlich, um die Pathophysiologie der Lungen-IR-Verletzung isoliert zu identifizieren und ihren Beitrag zu jedem Multi-Hit-Prozess zu untersuchen, bei dem eine Lungenverletzung eine Komponente ist.

Murine Lungen-IR-Modelle können verwendet werden, um die lungenspezifische Pathophysiologie mehrerer Prozesse zu untersuchen, einschließlich Lungentransplantation3, Lungenembolie4 und Lungenverletzung nach hämorrhagischem Trauma mit Reanimation5. Zu den derzeit verwendeten Modellen gehören chirurgische Lungentransplantation6, Hilarklemmung7, Ex-vivo-Lungenperfusion 8 und beatmete Lunge IR9. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für ein murinventiliertes Lungen-IR-Modell einer sterilen Lungenverletzung zur Verfügung. Es gibt mehrere Vorteile dieses Ansatzes (Abbildung 2), einschließlich der Tatsache, dass er minimale Hypoxie und minimale Atelektase induziert, und es ist ein Überlebenschirurgiemodell, das Langzeitstudien ermöglicht.

Gründe, dieses Modell von LIRI gegenüber anderen Modellen wie dem Hilar-Klemm- und Ex-vivo-Perfusionsmodell zu wählen, sind die folgenden: Dieses Modell minimiert die entzündlichen Beiträge von Atelektase, mechanischer Beatmung und Hypoxie; es bewahrt die zyklische Belüftung; es erhält ein intaktes in vivo zirkulatorisches Immunsystem, das auf die IR-Verletzung reagieren kann; Und schließlich erlaubt es als Überlebensverfahren die längerfristige Analyse der Mechanismen der sekundären Verletzungsentstehung (2-Treffer-Modelle) und der Verletzungsauflösung. Insgesamt glauben wir, dass dieses beatmete Lungen-IR-Modell die “reinste” Form der IR-Verletzung bietet, die experimentell untersucht werden kann.

Andere Publikationen haben die Verwendung der orotrachealen Intubation von Mäusen zur Durchführung von IT-Injektionen oder -Installationenbeschrieben 10,11, aber nicht als Ausgangspunkt für eine Überlebensoperation wie in diesem Modell. Die Platzierung eines Orotrachealtubus ermöglicht die Durchführung einer Lungenoperation, indem der Kollaps der operativen Lunge ermöglicht wird. Es ermöglicht auch die erneute Inflation der Lunge am Ende des Eingriffs, was für den Pneumothorax und für die Fähigkeit der Maus, am Ende der Eingriffe zur Selbstbeatmung zurückzukehren, entscheidend ist. Schließlich ist die Entfernung des gesicherten Orotrachealtubus ein einfaches Verfahren, das im Gegensatz zu einer invasiven Tracheotomie mit einer Überlebensoperation kompatibel ist. Dies ermöglicht längerfristige Forschungsstudien, die sich auf das Verständnis des Verlaufs und der Auflösung von LIRI und damit verbundenen Erkrankungen sowie auf die Erstellung von Modellen für chronische Verletzungen konzentrieren.

Protocol

Alle unten beschriebenen Verfahren und Schritte wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California San Francisco genehmigt. Jeder Mausstamm kann verwendet werden, obwohl einige Stämme im Vergleich zu anderen eine robustere Lungen-IR-Entzündungsreaktion haben12. Mäuse, die etwa 12-15 Wochen alt sind (30-40 g) oder älter, vertragen und überleben die Lungen-IR-Operation besser als jüngere Mäuse. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse können fü…

Representative Results

Entzündung, die durch einseitig beatmete sterile Lungenischämie-Reperfusionsverletzung (IR) verursacht wurde: Nach 1 h Ischämie beobachteten wir erhöhte Zytokinspiegel im Serum und im Lungengewebe sowohl durch ELISA als auch durch qRT-PCR, die nach 1 h nach der Reperfusion ihren Höhepunkt erreichten und innerhalb von 12-24 h nach der Reperfusion schnell zum Ausgangswert zurückkehrten13. Für Proben, die 3 h nach der Reperfusion entnommen wurden, beobachteten wir eine intensive neutrophile In…

Discussion

Dieses Manuskript beschreibt die Schritte zur Durchführung des von Dodd-o et al.9 entwickelten belüfteten Lungen-IR-Modells. Dieses Modell hat dazu beigetragen, molekulare Signalwege zu identifizieren, die an der Entstehung und Auflösung von Entzündungen aus Lungen-IR in Isolation 14,15,16,17, Lungen-IR in Kombination mit kobestehender Infektion 18 und Lungen-IR in Bezug auf die Darm-Lungen-Achse und den Beitrag des Darmmikrobioms beteiligt sind13,18,19<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der Abteilung für Anästhesie und perioperative Versorgung, der University of California San Francisco und des San Francisco General Hospital sowie durch einen NIH R01-Preis (an AP): 1R01HL146753 finanziert.

Materials

Equipment
Fiber Optic Light Pipe Cole-Parmer UX-41720-65 Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source AmScope SKU: CL-HL250-B Light source for fiberoptic lights
Germinator 500 Cell Point Scientific, Inc. No.5-1450 Bead Sterilizer
Heating Pad AIMS 14-370-223 Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) WAHL home products SKU 09854-600B To remove mouse hair on surgical site
Microscope Nikon SMZ-10 Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator Havard Apparatus Model 845 Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05 Clean tools that been used in operation
Warming Pad Kent Scientific RT-0501 To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale Cole-Parmer UX-11003-41 Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture Ethicon 683G For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture Ethicon Industry EP8734H Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) Aspen Surgical 372611 For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel Aspen Surgical 372612 For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps FST 11150-10 Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System FST 1. Base Plate (Nos. 18200-03)
2. Fixators (Nos. 18200-01)
3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12)
4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)
Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle COVIDIEN 05-561-20 For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps FST 11002-12 Skin level forceps
Needle holder/Needle driver FST 12565-14 for holding needles
Needles BD 305110 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps FST 00125-11 To hold PA; non-damaging gripper
Scissors FST 14060-09 Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps FST 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine Hospira, Inc. 0409-1159-02 Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine Covetrus North America 59122 Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant BAUSCH+LOMB Soothe Lubricant Eye Ointment Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution MEDLINE INDUSTRIES INC SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab BD brand  BD 326895 for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film KIRKLAND Stretch-Tite premium Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes Stoelting 50981 Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application Pwi-Wnaps 703033 used for applying eye lubricant
Top Sponges Dukal Corporaton Reorder # 5360 Stopping bleeding from skin/muscle

References

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Liao, W., Maruyama, D., Kianian, F., Tat, C., Tian, X., Hellman, J., Dodd-o, J. M., Prakash, A. A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery. J. Vis. Exp. (187), e64383, doi:10.3791/64383 (2022).

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