JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Флуоресцентно-активированное отрицательное сортировка нейронов в сочетании с секвенированием РНК одиночных ядер для изучения нейрогенной ниши гиппокампа

Published: October 20, 2022
doi:
10.3791/64369
, , , ,
1The Francis Crick Institute, 2MSD R&D Innovation Centre

Summary

Здесь представлен метод секвенирования одиночных ядер, выделенных из зубчатой извилины мыши, который исключает большинство нейронов посредством флуоресцентно-активированных ядер (FAN) сортировки. Этот подход генерирует высококачественные профили экспрессии и облегчает изучение большинства других типов клеток, представленных в нише, включая дефицитные популяции, такие как нервные стволовые клетки.

Abstract

Взрослый нейрогенез гиппокампа (AHN), который состоит из пожизненного поддержания пролиферативных и покоящихся нервных стволовых клеток (NSC) в субгранулированной зоне (SGZ) зубчатой извилины (DG) и их дифференцировки от недавно родившихся нейронов в гранулярные клетки в грануляном клеточном слое, хорошо подтвержден в многочисленных исследованиях. Использование генетически модифицированных животных, особенно грызунов, является ценным инструментом для исследования сигнальных путей, регулирующих AHN, и для изучения роли каждого типа клеток, которые составляют нейрогенную нишу гиппокампа. Чтобы решить последнюю проблему, методы, сочетающие изоляцию одиночных ядер с секвенированием следующего поколения, оказали значительное влияние в области AHN для идентификации сигнатур генов для каждой клеточной популяции. Однако необходима дальнейшая совершенствование этих методов для фенотипического профилирования более редких клеточных популяций в пределах ГД. Здесь мы представляем метод, который использует флуоресцентную активированную сортировку ядер (FANS) для исключения большинства нейронных популяций из одной суспензии ядер, выделенной из недавно рассеченного DG, путем выбора незапятнанных ядер для антигена NeuN, чтобы выполнить секвенирование РНК одиночных ядер (snRNA-seq). Этот метод является потенциальной ступенькой для дальнейшего исследования межклеточной регуляции AHN и выявления новых клеточных маркеров и механизмов у разных видов.

Introduction

Непрерывная генерация нейронов гиппокампа во взрослом возрасте, также известная как нейрогенез гиппокампа взрослых (AHN), связана с когнитивными функциями, такими как обучение, приобретение / клиренс памяти и разделение паттернов, и, по-видимому, является важным механизмом устойчивости при старении и нейродегенеративных заболеваниях для предотвращения когнитивного дефицита 1,2,3 . Грызуны были моделью выбора для изучения AHN с использованием нескольких методов, включая иммуноцитохимию и методы секвенирования следующего поколения (NGS). Перевод этих результатов на другие виды остается спорным. Действительно, AHN наблюдался у большинства видов, но степень, в которой он сохраняется на протяжении всей жизни, особенно у людей 4,5,6,7,8, регулярно обсуждается.

На сегодняшний день было подтверждено, что различные внутренние и внешние сигнальные пути модулируют AHN1. Однако влияние межклеточной связи на AHN только начинается9. Во-первых, это можно объяснить недостаточной специфичностью известных в настоящее время клеточных маркеров для проведения анализа in vivo с генетически модифицированными животными. Действительно, многие исследования опирались на маркеры, такие как двойной кортин или глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), которые экспрессируются в нескольких типах клеток1. Во-вторых, сложность и высокая степень клеточного разнообразия во взрослой нише гиппокампа10 создают технические проблемы для профилирования каждого типа клеток. Это особенно относится к биоинформационному анализу с перекрывающимися клеточными маркерами, используемыми в аналитических конвейерах для различных популяций, таких как НСК или глиальные клетки, что приводит к спорным выводам при оценке AHN 7,11. В-третьих, огромное количество нейронов подрывает исследование менее распространенных клеточных популяций, таких как астроциты, олигодендроциты или эпендимальные клетки, хотя их роль в тонкой настройке регуляции AHN становится заметной9. Вместе эти ограничения влияют на способность переводить результаты от грызунов к другим видам. Это особенно усиливается трудностью рекапитулирования in vitro сложной ткани, такой как нейрогенная ниша гиппокампа, и множеством препятствий для доступа к высококачественной ткани вместе с отсутствием стандартизированных протоколов обработки тканей в исследованиях с участием тканей человека12,13. Поэтому крайне важно разработать новые подходы к профилированию клеточных популяций и выявлению новых клеточных маркеров в зубчатой извилине (DG), что в конечном итоге приведет к лучшему пониманию различных вкладов каждого типа клеток в регуляцию AHN.

Чтобы достичь этого, изоляция одиночных клеток (sc) и одиночных ядер (sn) в сочетании с секвенированием РНК стала инструментом для исследования сложных тканей, таких как DG14. Таким образом, стратегии клеточного обогащения для выделения отдельных клеток из ниши гиппокампа взрослой мыши были выполнены в основном для изучения NSC15,16. Интересная стратегия обогащения ненейрональных клеток из DG была применена путем секвенирования GluR1/Cd24 двойных отрицательных одиночных клеток, в результате чего 1 408 клеток были секвенированы без четких кластеров между астроцитами и НСК после биоинформационного анализа17. Это может быть связано с резким ферментативным пищеварением, необходимым для одноклеточного препарата, который повреждает целостность клеток и РНК. Чтобы обойти эту техническую проблему, было разработано несколько методов, использующих изоляцию одиночных ядер, которые особенно подходят для сложных тканей11,18. Тем не менее, преобладание нейронов в DG или в более широком смысле в гиппокампально-энторинальной системе генерирует смещение выборки для изучения всей популяции клеток, присутствующих в этих областях мозга. Кроме того, ограниченное количество клеток, загружаемых для подготовки одноклеточных библиотек, подчеркивает присутствие основной клеточной популяции в аналитических конвейерах секвенированных одиночных ядер. Действительно, большие кластеры нейронов часто аннотируются и анализируются, в то время как другие клеточные популяции недопредставлены или пропущены 5,11.

В попытке преодолеть эти предубеждения и иметь возможность профилировать типы клеток, отличные от нейронов, присутствующих в мышином DG, в этом исследовании был разработан метод с использованием принципа флуоресцентной активированной сортировки ядер (FANS)18 , который исключает большинство нейронных популяций путем отрицательного отбора окрашенных одиночных ядер с нейрональным ядерным антигеном (NeuN, также известен как Rbfox3). Этот выбор антигена был обусловлен литературой, описывающей NeuN как надежный нейронный маркер19 , и необходимостью использования ядерного белка для этого подхода. NeuN-отрицательные FACS-отсортированные клетки затем были подготовлены для секвенирования РНК на платформе 10x Genomics. Результаты показывают, что исключение NeuN-экспрессирующих клеток позволяет получить специфическое, высококачественное транскриптомическое профилирование глиальных и редких клеточных популяций клеточного типа.

Protocol

Уход за животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Института Фрэнсиса Крика, а также руководящими принципами и законами Министерства внутренних дел Великобритании. Рисунок 1: Получение суспензии одиночных ядер из рассеченного DG взрослых мышей для snRNA-seq ненейрональных популяций. Блок-схема, описывающая основные этапы протокола, которые включают рассечение DG мыши, приготовление суспензии одиночных ядер, иммуноокрашивание NeuN и отрицательную сортировку NeuN-FANS перед переходом к snRNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 1. Рассечение DG (Сроки: 15 мин) Получение среды изоляции ядер 1 и 2 (NIM1 и NIM2), буфера гомогенизации (HB) и промывочной среды (WM) (Дополнительная таблица 1). Поместите все буферы, среды, реагенты и инструменты на лед до тех пор, пока это не понадобится. Поместите гомогенизатор Dounce (см. Таблицу материалов) на лед во время приготовления (минимум за 1 ч до стадии гомогенизации).ПРИМЕЧАНИЕ: NIM1 можно приготовить и хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев. NIM2, HB и WM должны быть свежеприготовленными.ВНИМАНИЕ: Осторожно манипулируйте DTT, ингибитором протеазы и Triton X-100. Эти соединения раздражают кожу и глаза, остро токсичны и опасны для водной среды. При использовании этих химических веществ носите защитные перчатки, одежду, защиту глаз и лица, тщательно мойте руки после обработки и избегайте попадания в окружающую среду. Усыплите 22-месячного самца мыши C57Bl/6J путем вывиха шейки матки в соответствии с процедурой20 Списка 1 Министерства внутренних дел.ПРИМЕЧАНИЕ: См. обсуждение для обоснования использования 22-месячной мыши в этом исследовании. Тем не менее, этот протокол может быть выполнен в любом возрасте на протяжении всей жизни. Рассекните мозг усыпленной мыши и перенесите его в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную ледяным 1x PBS (рисунок 1). Положите чашку Петри на лед. Удалите мозжечок с помощью скальпеля и разрезайте мозг пополам между обоими полушариями (вдоль сагиттальной оси). Наполните новую 10-сантиметровую чашку Петри ледяным PBS и положите ее на лед. Переместите половину мозга на новую чашку Петри. Используя бинокль, рассекните DG и повторите этот шаг, чтобы получить второй DG из второй половины мозга.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы (этапы 1.2-1.4) были адаптированы из ранее описанной процедуры21. Важно действовать как можно быстрее на этом этапе, чтобы сохранить целостность клеток. Переложите два DG в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce и добавьте 1 мл холодного HB. 2. Диссоциация тканей, выделение одиночных ядер и иммуноразрашивание против NeuN (время: 2 ч) Гомогенизируйте ткань 10 ударами рыхлого пестика «А», за которыми следует 15 ударов плотного пестика «В».ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация Dounce должна быть выполнена с раствором на льду с легкими ударами, чтобы уменьшить тепло, вызванное трением и вспениванием. Все буферы и оборудование должны быть предварительно охлаждены и храниться на льду во время процедуры. Переложить гомогенат в предварительно охлажденную трубку объемом 15 мл; промойте гомогенизатор Dounce 1 мл холодного HB и соедините в ту же трубку. Добавьте 3 мл HB в пробирку объемом 15 мл и высиживайте 5 мин на льду. Перемешайте 2x, аккуратно перевернув трубку. Предварительно смочите крышку сетчатого фильтра 70 мкм с 0,5 мл HB в пробирке объемом 50 мл. Процедите суспензию ядер со стадии 2.2, осторожно опрокинув трубку объемом 15 мл в клеточный ситечко. Промыть клеточный ситечко 0,5 мл HB. Снимите клеточный ситечко и центрифугируйте пробирку при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C, используя центрифугу с поворотным ведром. Выбросьте супернатант.ПРИМЕЧАНИЕ: Процеживание гомогената поможет уменьшить количество мусора, что имеет решающее значение для проточной цитометрии и стадий snRNA-seq вниз по течению. Осторожно повторно суспендировать гранулу в 4 мл HB с помощью пипетки P1000. Инкубировать на льду в течение 5 мин. Отжим при 500 х г в течение 10 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл WM. Предварительно смочите крышку сетчатого фильтра 35 мкм в пробирке объемом 15 мл с 0,5 мл WM. Процедите суспензию ядер со стадии 2,5 через клеточный фильтр, осторожно пипетируя 0,5 мл за один раз с помощью пипетки P1000. Промойте крышку ситечка 0,5 мл WM и поместите трубку на лед. Переложите фильтрат в новую трубку 15 мл и центрифугу в течение 5 мин и 4 °C при 500 х г. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл WM. Отжим при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл WM с мышиным анти-NeuN, Alexa Fluor 488-конъюгированным антителом (анти-NeuN-AF488, 1:32,000) и 1 мкг/мл DAPI. Насиживать в течение 45 мин на льду в темное время суток.ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации иммуноокрашивания изолированных ядер рекомендуется титровать антитело для определения оптимального разведения для анализа и сортировки проточной цитометрии. Затем запустите адекватные средства контроля, чтобы подтвердить, что условия окрашивания являются оптимальными. Например, с конъюгированным анти-NeuN-AF488 антителом был проведен отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления антитела, дополнительный рисунок 1A) и положительный контроль (т.е. окрашивание антителом, дополнительный рисунок 1B) для оценки сегрегации неокрашенных и окрашенных популяций. При начале работы с AF488-конъюгированным антителом для оценки специфичности рекомендуется запуск контроля AF488-конъюгированного изотипа. Если используется неконъюгированное антитело, для оценки неспецифического связывания вторичного антитела может потребоваться дополнительный контроль, такой как добавление вторичного антитела только к препарату ядер. 3. Флуоресцентно активированная сортировка ядер (FANS) для исключения нейронных популяций (время: 45 мин) Перенесите суспензию ядер с иммуноокрашенным эффектом в пробирку объемом 5 мл и держите ее на льду до начала процедуры проточной цитометрии.ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с более крупными кусками ткани, чем два мышиных DG, может потребоваться дальнейшее разбавление WM-буфером, чтобы избежать засорения FACS, если плотность ядер в растворе становится высокой. Вихрь образцов в течение 3 с на низкой скорости перед помещением трубок в прибор FACS (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: (Настройка FACS) Сортировочные машины должны быть выровнены в начале процедуры с калибровочными частицами в соответствии с рекомендациями производителя. Задержка падения калибровалась с помощью бусин или микросфер (см. Таблицу материалов) в соответствии с моделью FACS. Образцы сортировали при 4 °C в режиме чистоты. Чтобы уменьшить объем сбора, ядра сортировали через сопло 70 мкм при рекомендуемом давлении для проточного цитометра. Ядра были отсортированы в трубки с низким связыванием по 1,5 мл (см. Таблицу материалов), содержащие 50 мкл WM. Все коллекционные трубки были покрыты PBS + 5% BSA при 4 °C в течение ночи, чтобы снизить риск прилипания ядер к стенкам трубки. Чтобы получить данные из образца окрашенной суспензии ядер, установите затворы в ВЫСОТЕ DAPI и области DAPI, чтобы исключить клеточный мусор и агрегированные ядра (рисунок 2A). Кроме того, отделяйте одиночные ядра от любых оставшихся DAPI-окрашенных агрегатов или клеточного мусора, установив затворы в области бокового рассеяния бревна (SSC) и области прямого рассеяния (FCS) (рисунок 2B). Установите ворота для анти-NeuN-AF488 и FSC-области, чтобы изолировать NeuN-AF488-отрицательную популяцию, как показано на рисунке 2C. После анализа, используя описанную выше стратегию гатинга, отсортируйте NeuN-AF488-отрицательную популяцию в коллекторной трубке объемом 1,5 мл, заполненной 50 мкл WM.ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя описанной выше стратегии гатинга и процедуре рассечения для изоляции DG от мозга взрослой мыши, ожидается, что NeuN-AF488-отрицательная популяция будет представлять ~ 14% одиночных ядер. Рисунок 2: Выделение и транскриптомное профилирование ненейрональных клеточных популяций из стратегии DG. (A-C) Gating для выделения отрицательных одиночных ядер NeuN-AF488 и исключения клеточного мусора. (A) Точечный график FANS репрезентативного образца изолированных ядер, изображающий установку затвора для отбора ядер DAPI+ и исключения клеточного мусора и агрегатов. (B) Дальнейший отбор соответствующих одиночных ядер с использованием FSC-области и SSC-области. (C) Ворота для NeuN-AF488 для исключения положительной популяции и сортировки для отрицательных одиночных ядер. (D) Микрофотография хорошей суспензии одиночных ядер с минимальным количеством мусора и более высокой долей ядер хорошего качества (круглая форма, черная стрелка) по сравнению с ядрами плохого качества (белая стрелка). Шкала стержней = 50 мкм, 10 мкм (вставка). (Э,Ф) Анализ данных snRNA-seq и профилирование различных клеточных популяций, выделенных из DG 22-месячных самцов мышей C57BL/6J. Графики равномерного многообразного приближения и проекции для уменьшения размерности (UMAP) профилей одиночных ядер из (E) не facS-отсортированных клеток и (F) NeuN-отрицательных FACS-отсортированных клеток, окрашенных по типу клеток. (G) Круговые диаграммы, сравнивающие частоты идентифицированных типов клеток в обоих образцах. (H) Соответствующие метрики для секвенированных образцов: количество ядер, медианное число генов и транскриптов на ядро. (I) Скрипичные графики, показывающие распределение числа генов и транскриптов, обнаруженных для каждого типа клеток в обоих образцах. Астр. = астроциты, Олиг. = олигодендроциты, Vasc. = сосудистые клетки, CRCs = клетки Кахаля-Рециуса, Neur. = нейроны, Imm. = иммунные клетки, OPCs = клетки-предшественники олигодендроцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 4. Подготовка одноядерной суспензии для выполнения секвенирования одноядерной РНК (Время: 30 мин) После сортировки добавляют 1 мл PBS, содержащего 1% BSA, в коллекционную трубку, чтобы собрать капли на стенке трубки и вращать при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант, оставив 50 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с центрифугированными ядрами с осторожностью, так как может быть трудно наблюдать любую гранулу на дне трубки. Использование центрифуги с поворотным ведром поможет выбросить супернатант, не нарушая гранулу. Пипетируют осторожно для повторного суспендирования центрифугированных ядер. Добавьте 5 мкл суспензии ядер к 5 мкл трипанового синего в микропробирке объемом 0,5 мл.ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с синий трипан с осторожностью, так как он опасен для здоровья, может вызвать рак и подозревается в повреждении фертильности или будущего ребенка. Носите защитные перчатки, одежду, защиту глаз и лица. Не обращайтесь до тех пор, пока все меры предосторожности не будут прочитаны и поняты. Измерьте концентрацию и оцените жизнеспособность одноклеточной суспензии с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток (см. Таблицу материалов). Выполните подготовку библиотеки и секвенирование ядер, как описано в шаге 5.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, которые были признаны хорошим качеством для секвенирования, показали круглую и правильную форму ядер под микроскопом без клеточного мусора (рисунок 2D). Наличие гало вокруг ядерной мембраны или агрегация нескольких ядер вместе являются признаками поврежденных ядер, и такие клеточные суспензии не следует рассматривать для snRNA-seq (рисунок 2D). Измеренная концентрация ядер находилась в пределах 300-700 ядер/мкл. 5. Подготовка и последовательность библиотек ПРИМЕЧАНИЕ: Описание следующих шагов основано на собственной платформе секвенирования, используемой в данном исследовании (см. Таблицу материалов). Поэтому некоторые настройки могут отличаться при использовании другой платформы. Здесь описаны только ключевые шаги, и каждый параметр должен быть определен в соответствии с рекомендациями и протоколами от выбранного производителя, хотя и с оптимизацией перед первым использованием. Крайне важно обеспечить, чтобы подготовка библиотек выполнялась как можно быстрее после концентрации отсортированных суспензий ядер, чтобы избежать деградации РНК и обеспечить оптимальное качество секвенирования. Загрузите от 7 000 до 10 000 ядер в микрофлюидный одноклеточный чип. Разбиение нагруженных ядер в нанолитровой шкале капель с использованием прилагаемого контроллера и реагентов от выбранного поставщика. Ядра лиза внутри каждой капли и обратно транскрибируют РНК.ПРИМЕЧАНИЕ: Внутри капли все полученные кДНК имели один и тот же штрих-код ячейки. Подготовьте библиотеки для snRNA-seq, следуя рекомендациям выбранного поставщика и обеспечив совместимость с платформой секвенирования. Проверьте качество и концентрацию конечных библиотек с помощью методов электрофореза, флюорометрии или qPCR и, если применимо, объедините их эквимолярно перед секвенированием. Денатура объединила 3ʹ библиотеки экспрессии генов и разбавила в соответствии с рекомендацией производителя. Выполняйте парное, одинарное или двойное индексирование секвенирования на платформе секвенирования следующего поколения с глубиной секвенирования 50 000 пар чтения на ячейку.

Representative Results

Протокол, представленный здесь, описывает способ получения суспензии ненейрональных одиночных ядер, выделенных из DG, для выполнения snRNA-seq. С FANS или без него биоинформационная кластеризация выявила хорошо разделенные группы ядер, соответствующие известным типам клеток в пределах DG (рисунок 2E,F). В выборке, не отсортированной по FACS, большинство высококачественных ядер, которые были секвенированы, состояли из трех групп нейронов (84,9% от общего числа ядер для этого образца, рисунок 2E, G, H). Такие результаты ожидаются, учитывая, что наиболее представленными клеточными популяциями в DG являются гранулярные нейроны, другие возбуждающие нейроны (меченые возбуждающие нейроны) и тормозные нейроны10. Идентифицированные ненейрональные кластеры были в основном состоят из типов глиальных клеток (11,1%), включая астроциты, олигодендроциты и клетки-предшественники олигодендроцитов (OPCs), иммунные клетки (3,3%) и клетки Кахаля-Рециуса (0,6%). При выполнении ФАН исключить NeuN положительные популяции (NeuN-отрицательный FACS-отсортированный образец; Рисунок 2F,G,H), кластеры глиальных клеток стали преобладающими (81,3%). Выделение большего числа глиальных ядер позволяет лучше сегментировать различные популяции, которые группировались бы вместе без FANS. Действительно, при повторной кластеризации и анализе специфических генов, экспрессируемых либо в НСК, либо в астроцитах, выделяются четыре подкластера (дополнительный рисунок 2A, B). Рассматривая более специфические клеточные маркеры и оценивая уровни экспрессии генов по типам клеток, было обнаружено небольшое скопление НСК, отделяющихся отдельно от основных астроцитарных популяций с более высокой экспрессией Hopx и Notch2 и почти без экспрессии Aldh1a1 или Aqp4 (дополнительный рисунок 2C). Однако из-за перекрытия экспрессии генов между астроцитами и НСК потребуется дальнейший анализ для конкретного профилирования и идентификации различных подтипов клеток. Кроме того, образец NeuN-отрицательных FANS имел дополнительные кластеры, помеченные как сосудистые клетки (2,3%), которые охватывают эндотелиальные клетки, перициты и сосудистые лептоменингеальные клетки при перекрестных ссылках для экспрессии клеточных специфических маркеров (данные не показаны). Следуя указаниям для выбранного протокола для генерации библиотек для секвенирования, были получены высококачественные профили выражений с FANS или без них. Для образцов, секвенированных при 50 000 считываний на ядро, было обнаружено в среднем 2 510 генов на ядра для образца, не отсортированного по FACS (5 578 транскриптов, рисунок 2H) и 1 665,5 генов (3 508 транскриптов) для образца NeuN-отрицательного FANS, после фильтрации низкокачественных ядер (рисунок 2H, I). Эти метрики подтверждают, что этот протокол генерирует высококачественное транскриптомное профилирование отдельных ядер, сопоставимое с исследованиями с использованием различных подходов 22,23, и что процесс сортировки FACS не повреждает ядра для последующего snRNA-seq. Примечательно, что разница в количестве генов и транскриптов на ядра между двумя образцами обусловлена не более низким качеством данных, а высокой долей нейронов в образце, не отсортированном по FACS (84,9% по сравнению с 1,7% в NeuN-отрицательном образце FANS), которые имеют более высокую транскрипционную активность (2 660 генов / ядро и 6 170 транскриптов / ядро в образце, не отсортированном facS), чем средняя транскрипционная активность всех ненейрональных типов клеток (1 090 генов / ядро и 1 785 транскрипты/ядра, рисунок 2I). Вместе эти репрезентативные результаты показывают, что отбор отрицательных ядер NeuN с использованием FANS является мощным инструментом для выделения типов клеток с низким содержанием из свежерассеченной ткани мозга и выполнения высококачественного одноядерного транскриптомного профилирования этих различных клеточных популяций с помощью методов snRNA-seq. Дополнительный рисунок 1: Валидация иммуноокрашивания для FANS. Суспензию ядер инкубировали (А) без антитела против NeuN-AF 488 в качестве отрицательного контроля или (В) с антителом и пропускали через сортировщик FACS для подтверждения иммуноокрашающих состояний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: Анализ экспрессии генов и рекластеризация кластера астроцитов. (A) График равномерного многообразного приближения и проекции для уменьшения размерности (UMAP), показывающий кластеризацию 4968 ядер на основе профилей экспрессии всего генома из рисунка 2F. Вызовы сотового типа выполнялись на основе маркеров клеточного типа. (B) Кластер астроцитов, состоящий из 2579 ядер, выбранных из (A) для дальнейшего поднастройства для исследования потенциальных клеточных подтипов. Четыре подтипа были обнаружены кластеризацией Seurat (0-3), показанной различными цветами. (C) Уровни экспрессии генов специфических клеточных маркеров по четырем типам клеток. Все участки были получены с использованием пакета Seurat R24. Вкратце, количество РНК-seq было нормализовано для каждой клетки на общую экспрессию и умножено на масштабный коэффициент (10 000). Затем этот результат был преобразован в журнал. Преобразованные значения были масштабированы (дисперсия масштабирована до единицы) и центрированы (среднее значение установлено на ноль) в каждой ячейке до того, как UMAP был применен для вычисления внедрений, которые использовались в качестве значений на осях x и y. Графики представляют собой вывод метода размерного редукции на 2D-точечной диаграмме, где каждая точка представляет ячейку с соответствующими координатами x и y на основе встраиваний ячеек, определенных методом редукции. Клетки с похожими сигнатурами генов расположены близко друг к другу с помощью встраиваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3: Анализ экспрессии генов NeuN в нейрогенной линии. (A) График UMAP, показывающий кластеризацию нейрогенной линии из общедоступного набора данных15. UMAP были сгенерированы, как показано на дополнительном рисунке 2. (B) Уровни экспрессии генов специфических клеточных маркеров по всей нейрогенной линии, показывающие астроциты (Аквапорин 4 = Aqp4), НСК (белок только гомеодомена = Hopx), NeuN/Rbfox3 (НСК и промежуточные клетки-предшественники [IPC]) и циклические клетки (циклин-зависимая киназа 6 = Cdk6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная таблица 1: Композиции сред и буферов, используемых в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Для успешного выполнения этого протокола вскрытие DG является первым критическим шагом, который требует некоторой практики, чтобы сохранить его неповрежденным и ограничить загрязнение окружающих тканей. Исходя из опыта, отделение DG от гиппокампа может быть очень быстро приобретено квалифицированным исследователем, который затем может работать над совершенствованием своей техники, чтобы увеличить скорость рассечения и, следовательно, улучшить свежесть ткани для получения высококачественных данных. Аналогичным образом, подготовка и повторное суспендирование одиночных ядер требует согласованности в различных условиях, используемых в одном эксперименте, а также избежания чрезмерного пипетирования, которое может нарушить ядерную мембрану, высвобождая окружающие РНК, что приведет к смещению результатов секвенирования. В дополнение к рекомендациям, упомянутым ранее для получения высококачественных ядер, концентрация суспензии одиночных ядер также должна быть рассмотрена, прежде чем приступать к секвенированию. Действительно, в соответствии с руководящими принципами производителя, препарат с концентрацией выше 1 200 нук/мкл следует разбавлять, поскольку этот уровень концентрации ядер будет иметь более высокий риск образования мультиплетов, влияющих на последующие биоинформационные анализы. Следует отметить, что секвенирование образцов с концентрациями ядер ниже 500 нук/мкл может оказаться нецелесообразным из-за связанных с этим затрат. Также рекомендуется следовать рекомендациям продвинутого пользователя СУИМ, чтобы настроить все ограждения и оставаться в соответствии с настройками образцов и биологических реплик. Аналогичным образом, подготовка библиотек для секвенирования РНК влечет за собой некоторую подготовку для достижения высококачественных результатов, и большинство поставщиков имеют отличную поддержку для эффективного достижения этого. Этот метод был протестирован только со свежими тканями в этом исследовании; тем не менее, FANS также был выполнен с замороженной тканью25. Поэтому разумно предположить, что этот протокол может быть выполнен с замороженной тканью, хотя и с незначительной оптимизацией.

Этот протокол был разработан с учетом конкретного последующего приложения, которое заключается в исследовании клеточных популяций, отличных от нейронов в нейрогенной нише гиппокампа. Действительно, растущие линии доказательств указывают на то, что нарушение AHN при старении может быть отнесено к окружающим клеткам в нише 1,2,3,9. В частности, астроциты и олигодендроциты выступают в качестве ключевых регуляторов AHN; однако их изоляция от DG в сочетании с секвенированием РНК дала смешанные результаты, что делает эту гипотезу сложной для оценки с помощью этого метода 1,17. Такой подход FACS к сортировке NeuN-отрицательных ядер позволил выделить больше астроцитов и олигодендроцитов по сравнению с образцами, которые не были отсортированы FACS, что позволяет улучшить биоинформационный анализ. Этот протокол применим во всех возрастах на протяжении всей жизни, и репрезентативные данные, представленные здесь с тканями старых животных, обеспечивают доказательство концепции, что этот метод является надежным для исследования стареющей нейрогенной ниши гиппокампа. Чтобы расширить использование этого метода и адаптировать его к различным биологическим вопросам, важно учитывать, что другие антигены нейронной ядерной мембраны могут быть протестированы вместе с тщательным титрованием лучших проверенных антител для этих маркеров. Например, при изучении процесса дифференцировки нейронов от НСК в ДГ некоторые типы клеток, такие как клетки типа 2 или нейробласты, начинают экспрессировать NeuN (дополнительный рисунок 3). Поэтому для специального исследования этих типов клеток потребуется еще один антиген. И наоборот, некоторые нейроны все еще были идентифицированы в этом исследовании после NeuN-отрицательной FACS-сортировки, возможно, из-за низкой или нулевой экспрессии NeuN в этих популяциях (например, кортикальные нейроны Cajal-Retzius19). Кроме того, сообщалось, что NeuN экспрессируется в субпопуляциях олигодендроцитов26, что может дать предвзятые результаты, если эти субпопуляции представляют интерес. Таким образом, выбор антигена при начале использования ФАН должен быть тщательно продуман, чтобы избежать включения или исключения клеточных популяций, что исключало бы точный ответ на конкретный биологический вопрос. В соответствии с этим также рекомендуется, чтобы каждый результат секвенирования дополнительно проверялся ортогональными анализами (например, иммуногистохимией или РНК-областью) перед проверкой или опровержением проверенной гипотезы с помощью этого протокола. Наконец, этап с участием FANS может быть дополнительно развит, чтобы включить более одного антитела с более продуманной стратегией сортировки для исключения и/или включения желаемых клеточных популяций.

В конечном счете, технологии, описанные в этом протоколе, могут иметь некоторые ограничения при использовании с другими видами. Например, ниша очень хорошо определена у грызунов с присутствием пролиферативных и покоящихся НСК или недавно родившихся нейронов, ограниченных в определенных субрегионах ГД, но до сих пор неясно, как нейрогенная ниша гиппокампа должна быть очерчена у других видов. Действительно, пролиферативные клетки не выровнены в пределах непрерывной зоны DG у нечеловеческих приматов и людей, а скорее разбросаны вокруг нее и также могут присутствовать в миндалине7. Таким образом, препарирование и изоляция более широких областей, чем ГД по другим видам, потенциально повлияет на использование этого протокола. В частности, этапы диссоциации и тритурации для подготовки ткани должны быть оптимизированы при работе с более крупными кусочками ткани27,28. Что касается биоинформационного анализа, в то время как грызуны, размещенные в инбриде, имеют очень однородный и очень хорошо аннотированный геном, генетическая изменчивость генома человека в сочетании с недостаточным количеством клеточных маркеров для четкого различения различных клеточных популяций (например, НСК и астроцитов) требует большой нормализации для анализа, которая может привести к различным выводам при идентификации небольшого кластера клеток7, 11. В таких ситуациях обогащение клеток все еще может быть предпочтительным вариантом или должно использоваться наряду с другими стратегиями для повышения аналитической мощи.

Тем не менее, нынешний подход может позволить исследовать роль недостаточно изученных, хотя и потенциально важных клеточных популяций в регуляции AHN. Это может быть особенно актуально для популяций астроцитов, которые играют центральную роль в возникновении и прогрессировании нейродегенеративных заболеваний 29,30. Это исследование показало, что астроциты и другие редкие клеточные популяции могут быть идентифицированы и профилированы просто путем исключения подавляющего большинства нейронов, присутствующих в DG. Другие исследования с использованием различных подходов не смогли достичь аналогичного восстановления ядер из того же диапазона клеточных популяций 5,11,17. Более того, результаты этого исследования показывают, что можно использовать этот подход для выделения кластера NSC без специфического обогащения этой клеточной популяции15.

В заключение, следование и совершенствование этого метода было бы шагом вперед для решения нерешенных вопросов, связанных с контекстуальной ролью нейрогенной ниши гиппокампа для модуляции AHN. В частности, это может принести новое понимание уровней экспрессии генов в стареющем и больном мозге в клеточных популяциях, связанных с регуляцией AHN9, поддержать идентификацию потенциальной гетерогенности NSC1 или рассмотреть роль сосудистой системы в AHN. В конечном счете, этот метод может быть адаптирован для других ниш взрослых стволовых клеток с аналогичными вопросами и проблемами.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Лахлана Харриса и Пьеро Риго за техническую поддержку, а также Джейсона М. Усланера и Дитте Ловатт за обратную связь по рукописи. Эта работа была поддержана грантовой поддержкой mrc и предконкурсным исследовательским сотрудничеством с MSD, Институтом Фрэнсиса Крика, который получает финансирование от Cancer Research UK (FC0010089), Совета медицинских исследований Великобритании (FC0010089), Wellcome Trust (FC0010089) и премии Wellcome Trust Investigator Award для FG (106187 / Z / 14 / Z). Приносим извинения многим авторам, чьи работы мы не смогли обсудить и процитировать из-за нехватки места.

Materials

0.5ml microtube Eppendorf 30124537
10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres Polysciences 15700-10
15 mL polypropylene centrifuge tubes Corning 430052
2 pairs of sterile Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma Aldrich D9564-10MG
4150 TapeStation System Agilent N/A
5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap Falcon 352063
5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Falcon 352235
50 mL polypropylene centrifuge tubes Corning 430829
70 µm cell strainer Falcon 352350
8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles BD Biosciences RCP-30-5A
Accudrop Beads BD Biosciences N/A
Allegra X-30R Centrifuge Beckman Coulter N/A
Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated Millipore MAB377X
 BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP Beckman Coulter N/A
Chromium Controller 10x Genomics N/A
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 10x Genomics PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7.5% Gibco 15260037
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) KIMBLE D8938-1SET
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml Eppendorf 30108116
 Halt, 100x Protease inhibitor ThermoFisher 78429
HiSeq 4000 Sequencing System Illumina N/A Sequencing configuration: 28-8-0-91
KCl Any chemical supplier Laboratory made
LUNA-FX7 Automated Cell counter Logos Biosystems N/A
MgCl2 Any chemical supplier Laboratory made
N°10 guarded sterile disposable scalpels Swann-Morton 6601
Nuclease-free water Sigma Aldrich W4502-1L
Pair of sterile student surgical scissors Fine Science Tools 91401-12
PBS Any chemical supplier Laboratory made
RNase Inhibitor 40 U µl-1 Ambion AM2684
RNasin 40 U µl-1 Promega N211A
Sterile Petri dish Corning 430167
Sucrose Sigma Aldrich 59378-500G
Tris buffer, pH 8.0 Any chemical supplier Laboratory made
Triton X-100 10% (v/v) Sigma Aldrich T8787-250ML
Trypan blue Invitrogen T10282
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
  2. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  3. Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
  4. Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
  5. Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
  6. Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  7. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  8. Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
  9. Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
  10. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  11. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  12. Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
  13. Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
  14. Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
  15. Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
  16. Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  17. Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
  18. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  19. Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
  20. . Guidance on the Operation of ASPA Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022)
  21. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
  22. Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer’s disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
  23. Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
  24. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  25. Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
  26. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  27. Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
  28. Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
  29. Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
  30. Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).

Tags

Fluorescence-Activated Nuclei Negative SortingSingle Nuclei RNA SequencingHippocampal Neurogenic NicheNeural Stem CellsAstrocytesOligodendrocytesAdult Hippocampal NeurogenesisDentate GyrusBrain DissectionDounce HomogenizerNuclei SuspensionCell StrainerCentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kerloch, T., Lepko, T., Shkura, K., Guillemot, F., Gillotin, S. Fluorescence-Activated Nuclei Negative Sorting of Neurons Combined with Single Nuclei RNA Sequencing to Study the Hippocampal Neurogenic Niche. J. Vis. Exp. (188), e64369, doi:10.3791/64369 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image