מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס
Summary
מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.
Abstract
נוירוגנזה היפוקמפלית בוגרת (AHN), המורכבת מתחזוקה לכל החיים של תאי גזע עצביים מתרבים ושקטים (NSCs) בתוך האזור התת-גרגירי (SGZ) של הפיתול המשונן (DG) והתמיינותם מנוירונים שזה עתה נולדו לתאי גרגיר בשכבת תאי הגרגיר, מאומתת היטב במחקרים רבים. שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית, במיוחד מכרסמים, הוא כלי רב ערך לחקור מסלולי איתות המווסתים AHN ולחקור את התפקיד של כל סוג תא המרכיבים את הנישה הנוירוגנית בהיפוקמפוס. כדי לענות על כך, לשיטות המשלבות בידוד גרעינים בודדים עם ריצוף מהדור הבא הייתה השפעה משמעותית בתחום ה-AHN לזיהוי חתימות גנים עבור כל אוכלוסיית תאים. עם זאת, יש צורך בעידון נוסף של טכניקות אלה כדי ליצור פרופיל פנוטיפי של אוכלוסיות תאים נדירות יותר בתוך ה-DG. כאן אנו מציגים שיטה המשתמשת במיון גרעינים מופעלים פלואורסצנטיים (FANS) כדי להוציא את רוב אוכלוסיות הנוירונים מתרחיף גרעינים יחיד שבודד מ-DG שזה עתה נותח, על ידי בחירת גרעינים לא מוכתמים עבור האנטיגן NeuN, על מנת לבצע ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA-seq). שיטה זו היא אבן דרך פוטנציאלית לחקור עוד יותר את הוויסות הבין-תאי של ה-AHN ולחשוף סמנים ומנגנונים תאיים חדשים בין מינים.
Introduction
הדור המתמשך של נוירונים בהיפוקמפוס בבגרות, הידוע גם בשם נוירוגנזה בהיפוקמפוס למבוגרים (AHN), קשור לתפקודים קוגניטיביים כגון למידה, רכישה/פינוי זיכרון והפרדת דפוסים, ונראה כי הוא מנגנון חשוב של עמידות בהזדקנות ומחלות ניווניות של מערכת העצבים למניעת ליקויים קוגניטיביים 1,2,3 . מכרסמים היו המודל המועדף לחקור AHN באמצעות מספר שיטות, כולל אימונוציטוכימיה ושיטות ריצוף מהדור הבא (NGS). התרגום של תוצאות אלה למינים אחרים נותר שנוי במחלוקת. ואכן, AHN נצפה ברוב המינים, אך המידה שבה הוא נמשך לאורך כל החיים, במיוחד אצל בני אדם 4,5,6,7,8, נתונה לוויכוח קבוע.
עד כה, מסלולי איתות פנימיים וחיצוניים שונים אושרו לווסת AHN1. עם זאת, ההשפעה של תקשורת בין-תאית על AHN רק מתעוררת9. ניתן לייחס זאת תחילה לספציפיות לא מספקת של סמני התאים הידועים כיום כדי לבצע ניתוח in vivo עם בעלי חיים מהונדסים גנטית. ואכן, מחקרים רבים הסתמכו על סמנים כגון דאבלקורטין או חלבון חומצי פיברילארי גליאלי (GFAP) המתבטאים במספר סוגי תאים1. שנית, המורכבות והרמה הגבוהה של מגוון התאים בנישה ההיפוקמפלית הבוגרת10 מביאה אתגרים טכניים לפרופיל כל סוג תא. זה המקרה במיוחד עבור ניתוח ביואינפורמטי עם סמנים תאיים חופפים המשמשים בצינורות אנליטיים עבור אוכלוסיות שונות, כגון תאי גזע עצביים או תאי גליה, וכתוצאה מכך מסקנות שנויות במחלוקת בעת הערכת AHN 7,11. שלישית, המספר העצום של תאי עצב מערער את החקירה של אוכלוסיות תאים פחות בשפע, כגון אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים או תאים אפנדימליים, למרות שתפקידם בוויסות הכוונון העדין של AHN הופך להיות בולט9. יחד, מגבלות אלה משפיעות על היכולת לתרגם תוצאות של מכרסמים למינים אחרים. הדבר מועצם במיוחד על ידי הקושי לשחזר במבחנה רקמה מורכבת, כגון הנישה הנוירוגנית בהיפוקמפוס, ועל ידי המכשולים הרבים לגישה לרקמות באיכות גבוהה יחד עם היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לעיבוד רקמות במחקרים המערבים רקמות אנושיות12,13. לכן חיוני לפתח גישות חדשות לפרופיל אוכלוסיות תאים ולזיהוי סמנים תאיים חדשים בתוך הפיתול המשונן (DG) שבסופו של דבר יובילו להבנה טובה יותר של התרומות השונות של כל סוג תא לוויסות AHN.
כדי להשיג זאת, בידוד של תאים בודדים (sc) וגרעינים בודדים (sn) בשילוב עם ריצוף RNA הפך לחיוני לחקר רקמות מורכבות כגון DG14. לפיכך, אסטרטגיות של העשרת תאים לבידוד תאים בודדים מנישה היפוקמפלית בוגרת של עכברים בוצעו בעיקר כדי לבחון תאי גזע עצביים15,16. אסטרטגיה מעניינת להעשרת תאים שאינם נוירונים מה-DG יושמה על ידי ריצוף GluR1/Cd24 תאים בודדים שליליים כפולים שהביאו לריצוף של 1,408 תאים ללא אשכולות מובחנים בין אסטרוציטים לתאי גזע עצביים לאחר ניתוח ביואינפורמטי17. ייתכן שהסיבה לכך היא העיכול האנזימטי הקשה הנדרש להכנת תא בודד שפוגע בשלמות התא וב-RNA. כדי לעקוף בעיה טכנית זו, פותחו מספר שיטות המשתמשות בבידוד גרעינים בודדים במקום זאת והן מתאימות במיוחד לרקמות מורכבות11,18. עם זאת, הדומיננטיות של תאי עצב בתוך ה-DG או באופן רחב יותר בתוך מערכת ההיפוקמפוס-אנטורינל יוצרת הטיית דגימה כדי לחקור את מכלול אוכלוסיות התאים הקיימות באזורי מוח אלה. בנוסף, המספר המצומצם של תאים לטעינה לצורך הכנת ספריות תאים בודדים מדגיש את נוכחותה של אוכלוסיית התאים העיקרית בצינורות אנליטיים של גרעינים בודדים מרוצפים. ואכן, אשכולות נוירונים גדולים עוברים לעתים קרובות ביאורים וניתוחים, בעוד שאוכלוסיות תאים אחרות סובלות מתת-ייצוג או מפספסות 5,11.
בניסיון להתגבר על הטיות אלה ולהיות מסוגלים ליצור פרופיל של סוגי תאים שאינם תאי עצב הנמצאים ב-DG של העכבר, הומצאה שיטה במחקר זה תוך שימוש בעקרון של מיון גרעינים מופעלים פלואורסצנטיים (FANS)18 שאינה כוללת את רוב האוכלוסיות העצביות על ידי בחירה שלילית של גרעינים בודדים מוכתמים עם אנטיגן גרעיני עצבי (NeuN, ידוע גם בשם Rbfox3). בחירה זו באנטיגן הונחתה על ידי הספרות המתארת את NeuN כסמן עצבי אמין19 ועל ידי הצורך להשתמש בחלבון גרעיני לגישה זו. לאחר מכן הוכנו תאים ממוינים FACS שליליים ל-NeuN לריצוף RNA על פלטפורמת 10x Genomics. התוצאות מראות כי הדרה של תאים המבטאים NeuN מאפשרת פרופיל תעתיקי ספציפי ואיכותי מסוג תא של אוכלוסיות תאי גליה ותאים נדירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה, כריתת ה- DG היא הצעד הקריטי הראשון, הדורש תרגול מסוים כדי לשמור עליו לא פגום ולהגביל את הזיהום מהרקמות הסובבות. מניסיון, הפרדת ה-DG מההיפוקמפוס יכולה להירכש מהר מאוד על ידי חוקר מיומן שיכול לעבוד על זיקוק הטכניקה שלהם כדי להגביר את מהירות הדיסקציה ולכן לשפר את טריות הרקמה כדי לייצר נתונים באיכות גבוהה. ברוח דומה, הכנה וחידוש של גרעינים בודדים דורשת עקביות בין התנאים השונים המשמשים בניסוי יחיד, אך גם הימנעות מפיפטינג מוגזם שעלול לשבש את שחרור הרנ”א הסביבתי שיטה את תוצאות הריצוף. בנוסף להמלצות שהוזכרו קודם לכן להכנת גרעינים באיכות גבוהה, יש לשקול גם את ריכוז ההשעיה של הגרעין הבודד לפני שממשיכים בריצוף. ואכן, על פי הנחיות היצרן, יש לדלל תכשיר עם ריכוז גבוה מ-1,200 nuc/μL, שכן רמה זו של ריכוז גרעינים תהיה בעלת סיכון גבוה יותר ליצירת הכפלות המשפיעות על ניתוחים ביואינפורמטיים במורד הזרם. יש לציין כי ריצוף דגימות עם ריכוזי גרעינים מתחת ל-500 nuc/μL עשוי שלא להיות כדאי בשל העלות הכרוכה בכך. מומלץ גם לעקוב אחר עצתו של משתמש FACS מתקדם כדי להגדיר את כל ה- gating ולהישאר עקביים עם ההגדרות על פני דגימות ושכפולים ביולוגיים. כמו כן, הכנת ספריות לריצוף RNA כרוכה בהכשרה מסוימת כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה ולרוב הספקים יש תמיכה מצוינת להשיג זאת ביעילות. שיטה זו נבדקה רק עם רקמה טרייה במחקר זה; עם זאת, FANS בוצע גם עם רקמה קפואה25. לכן סביר להניח כי פרוטוקול זה יכול להתבצע עם רקמה קפואה אם כי עם אופטימיזציה קלה.
פרוטוקול זה פותח מתוך מחשבה על יישום מסוים במורד הזרם, שהוא לחקור אוכלוסיות תאים שאינן נוירונים בתוך הנישה הנוירוגנית בהיפוקמפוס. ואכן, קווי ראיות הולכים וגדלים מצביעים על כך שניתן לייחס פגיעה ב-AHN בהזדקנות לתאים הסובבים בתוך הנישה 1,2,3,9. בפרט, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים מתגלים כרגולטורים מרכזיים של AHN; עם זאת, הבידוד שלהם מה-DG בשילוב עם ריצוף RNA הניב תוצאות מעורבות, מה שהופך את ההשערה הזו למאתגרת להערכה בטכניקה זו 1,17. גישה זו של מיון FACS גרעינים שליליים של NeuN אפשרה בידוד של יותר אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים בהשוואה לדגימות שלא מוינו על ידי FACS, מה שמאפשר ניתוח ביואינפורמטי טוב יותר. פרוטוקול זה ישים בכל הגילאים לאורך תוחלת החיים והנתונים המייצגים המוצגים כאן עם רקמות מבעלי חיים ישנים מספקים הוכחת היתכנות לכך ששיטה זו חזקה לחקר הנישה הנוירוגנית המזדקנת בהיפוקמפוס. כדי להרחיב את השימוש בשיטה זו ולהתאים אותה לשאלות ביולוגיות שונות, חשוב לשקול כי אנטיגנים אחרים של ממברנה גרעינית עצבית יכולים להיבדק יחד עם טיטרציה יסודית של הנוגדנים המאומתים הטובים ביותר עבור סמנים אלה. לדוגמה, כאשר חוקרים את תהליך ההתמיינות העצבית מתאי גזע עצביים ב-DG, סוגי תאים מסוימים, כגון תאים מסוג 2 או נוירובלסטים, מתחילים לבטא את NeuN (איור משלים 3). לכן, יהיה צורך באנטיגן אחר כדי לחקור באופן ספציפי את סוגי התאים האלה. לעומת זאת, חלק מתאי העצב עדיין זוהו במחקר זה לאחר מיון FACS שלילי ל-NeuN, אולי בגלל ביטוי נמוך או ללא ביטוי של NeuN באוכלוסיות אלה (למשל, נוירונים קחאל-רציוס קליפת המוח19). בנוסף, דווח כי NeuN באה לידי ביטוי בתת-אוכלוסיות של אוליגודנדרוציטים26, מה שיכול לתת תוצאות מוטות אם תת-אוכלוסיות אלה היו מעניינות. לכן, הבחירה של אנטיגן כאשר מתחילים להשתמש FANS צריך להיחשב בזהירות כדי למנוע הכללה או הדרה של אוכלוסיות תאים שימנעו תשובה מדויקת לשאלה ביולוגית ספציפית. בהסכמה עם זה, מומלץ גם שכל תוצאת ריצוף תאושר עוד יותר על ידי בדיקות אורתוגונליות (למשל, אימונוהיסטוכימיה או היקף RNA) לפני אימות או הפרכה של ההשערה הנבדקת בפרוטוקול זה. לבסוף, ניתן לפתח עוד יותר את השלב הכרוך ב-FANS כך שיכלול יותר מנוגדן אחד עם אסטרטגיית מיון משוכללת יותר כדי לא לכלול ו/או לכלול אוכלוסיות תאים רצויות.
בסופו של דבר, לטכנולוגיות המתוארות בפרוטוקול זה עשויות להיות מגבלות מסוימות כאשר משתמשים בהן עם מינים אחרים. לדוגמה, הנישה מוגדרת היטב במכרסמים עם נוכחות של תאי גזע עצביים מתרבים ושקטים או נוירונים שזה עתה נולדו המוגבלים בתוך תת-אזורים ספציפיים של DG, אך עדיין לא ברור כיצד יש להגדיר את הנישה הנוירוגנית בהיפוקמפוס במינים אחרים. ואכן, תאים מתרבים אינם מיושרים בתוך אזור רציף של ה-DG בפרימטים ובבני אדם שאינם בני אדם, אלא מפוזרים סביבו ועשויים להימצא גם באמיגדלה7. לכן, ניתוח ובידוד אזורים רחבים יותר מאשר DG במינים אחרים עשוי להשפיע על השימוש בפרוטוקול זה. במיוחד, שלבי הדיסוציאציה והטריטורציה להכנת רקמה יצטרכו להיות אופטימליים תוך כדי עבודה עם חתיכות גדולות יותר של רקמה27,28. באשר לאנליזה ביואינפורמטית, בעוד שלמכרסמים גזעיים יש גנום הומוגני מאוד ומבואר היטב, השונות הגנטית של הגנום האנושי בשילוב עם מספר לא מספיק של סמנים תאיים כדי להבחין בבירור בין אוכלוסיות תאים שונות (למשל, תאי גזע עצביים ואסטרוציטים) דורשת הרבה נורמליזציה לניתוח שיכול להוביל למסקנות שונות כאשר צביר קטן של תאים מזוהה7, 11. במצבים כאלה, העשרת תאים עשויה עדיין להיות אפשרות מועדפת או שיש להשתמש בה לצד אסטרטגיות אחרות להגברת הכוח האנליטי.
עם זאת, הגישה הנוכחית יכולה לאפשר לחקור את תפקידן של אוכלוסיות תאים מוחלשות, אם כי בעלות פוטנציאל חשוב, בוויסות של AHN. זה יכול להיות המקרה במיוחד עבור אוכלוסיות של אסטרוציטים, אשר ממלאים תפקיד מרכזי בהתפרצות והתקדמות של מחלות נוירודגנרטיביות29,30. מחקר זה הראה כי ניתן לזהות אסטרוציטים ואוכלוסיות תאים נדירים אחרים ולתאר אותם פשוט על ידי אי הכללת הרוב המכריע של תאי העצב הנמצאים בתוך ה-DG. מחקרים אחרים שהשתמשו בגישות שונות לא הצליחו להשיג התאוששות דומה של גרעינים מאותו טווח של אוכלוסיות תאים 5,11,17. יתר על כן, תוצאות מחקר זה מראות כי ניתן להשתמש בגישה זו כדי לבודד אשכול NSC ללא העשרה ספציפית של אוכלוסיית תאים זו15.
לסיכום, מעקב ושיפור שיטה זו יהיה צעד קדימה כדי להתמודד עם שאלות יוצאות דופן הקשורות לתפקיד ההקשר של נישה נוירוגנית בהיפוקמפוס עבור אפנון של AHN. בפרט, הוא יכול להביא תובנות חדשות על רמות ביטוי גנים במוחות זקנים וחולים באוכלוסיות תאים הקשורות לוויסות של AHN9, לתמוך בזיהוי הטרוגניות פוטנציאלית של תאי גזע עצביים1 או לטפל בתפקיד כלי הדם ב-AHN. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לנישות אחרות של תאי גזע בוגרים עם שאלות וסוגיות דומות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ללכלן האריס ופיירו ריגו על התמיכה הטכנית ולג’ייסון מ. אוסלנר ודיטה לובאט על מתן משוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי תמיכת מענקים מ- MRC ושיתוף פעולה מחקרי טרום תחרותי עם MSD, מכון פרנסיס קריק, המקבל את המימון שלו מ- Cancer Research UK (FC0010089), המועצה למחקר רפואי בבריטניה (FC0010089), קרן Wellcome (FC0010089) ועל ידי פרס חוקר אמון Wellcome ל- FG (106187 / Z / 14 / Z). אנו מתנצלים בפני הסופרים הרבים שאת עבודתם לא יכולנו לדון ולצטט בגלל חוסר מקום.
Materials
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- . Guidance on the Operation of ASPA Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022)
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer’s disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).
