الفرز السلبي للنوى المنشطة بالفلورة للخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى لدراسة مكانة الحصين العصبية
Summary
تظهر هنا طريقة لتسلسل النوى المفردة المعزولة من التلفيف المسنن للفأر الذي يستبعد معظم الخلايا العصبية من خلال فرز النوى المنشطة بالتألق (FAN). يولد هذا النهج ملفات تعريف تعبير عالية الجودة ويسهل دراسة معظم أنواع الخلايا الأخرى الممثلة في مكانه ، بما في ذلك المجموعات السكانية النادرة مثل الخلايا الجذعية العصبية.
Abstract
تكوين الخلايا العصبية الحصينية للبالغين (AHN) ، والذي يتكون من صيانة مدى الحياة للخلايا الجذعية العصبية التكاثرية والهادئة (NSCs) داخل المنطقة شبه الحبيبية (SGZ) من التلفيف المسنن (DG) وتمايزها عن الخلايا العصبية المولودة حديثا إلى الخلايا الحبيبية في طبقة الخلايا الحبيبية ، تم التحقق من صحتها جيدا عبر العديد من الدراسات. يعد استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا ، وخاصة القوارض ، أداة قيمة للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنظم AHN ودراسة دور كل نوع من الخلايا التي تشكل مكانة الحصين العصبية. لمعالجة هذا الأخير ، كان للطرق التي تجمع بين عزل النواة المفردة وتسلسل الجيل التالي تأثير كبير في مجال AHN لتحديد التوقيعات الجينية لكل مجموعة خلية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لهذه التقنيات لتحديد ملامح مجموعات الخلايا النادرة ظاهريا داخل DG. هنا ، نقدم طريقة تستخدم فرز النوى المنشطة الفلورية (FANS) لاستبعاد معظم المجموعات العصبية من معلق نواة واحد معزول من DG الذي تم تشريحه حديثا ، عن طريق اختيار نوى غير ملوثة لمستضد NeuN ، من أجل إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNA-seq). هذه الطريقة هي نقطة انطلاق محتملة لمزيد من التحقيق في التنظيم بين الخلايا ل AHN والكشف عن علامات وآليات خلوية جديدة عبر الأنواع.
Introduction
يرتبط التوليد المستمر للخلايا العصبية الحصينية في مرحلة البلوغ ، والمعروف أيضا باسم تكوين الخلايا العصبية الحصينية للبالغين (AHN) ، بالوظائف المعرفية مثل التعلم واكتساب / إزالة الذاكرة وفصل الأنماط ويبدو أنه آلية مهمة للمرونة في الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية لمنع العجز المعرفي1،2،3 . كانت القوارض هي النموذج المفضل لدراسة AHN باستخدام عدة طرق ، بما في ذلك الكيمياء المناعية وطرق تسلسل الجيل التالي (NGS). لا تزال ترجمة هذه النتائج إلى الأنواع الأخرى مثيرة للجدل. في الواقع ، لوحظ AHN في معظم الأنواع ولكن مدى استمراره طوال الحياة ، وخاصة في البشر4،5،6،7،8 ، تتم مناقشته بانتظام.
حتى الآن ، تم تأكيد العديد من مسارات الإشارات الداخلية والخارجية لتعديل AHN1. ومع ذلك ، فإن تأثير الاتصال بين الخلايا على AHN هو فقطالناشئة 9. يمكن أن يعزى هذا أولا إلى عدم كفاية خصوصية علامات الخلايا المعروفة حاليا لإجراء تحليل في الجسم الحي مع الحيوانات المعدلة وراثيا. في الواقع ، اعتمدت العديد من الدراسات على علامات مثل الكورتين المزدوج أو البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) التي يتم التعبير عنها في أنواع خلايا متعددة1. ثانيا ، يجلب التعقيد والدرجة العالية من تنوع الخلايا في مكانة الحصينالبالغة 10 تحديات تقنية لتعريف كل نوع من الخلايا. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للتحليل المعلوماتي الحيوي مع العلامات الخلوية المتداخلة المستخدمة في خطوط الأنابيب التحليلية لمختلف السكان ، مثل NSCs أو الخلايا الدبقية ، مما يؤدي إلى استنتاجات مثيرة للجدل عند تقييم AHN 7,11. ثالثا ، يقوض العدد الهائل من الخلايا العصبية التحقيق في مجموعات الخلايا الأقل وفرة ، مثل الخلايا النجمية أو الخلايا قليلة التغصن أو الخلايا العصبية ، على الرغم من أن دورها في تنظيم الضبط الدقيق ل AHN أصبح بارزا9. تؤثر هذه القيود معا على القدرة على ترجمة النتائج من القوارض إلى الأنواع الأخرى. يتضخم هذا بشكل خاص بسبب صعوبة تلخيص الأنسجة المعقدة في المختبر ، مثل مكانة الحصين العصبية ، والعقبات العديدة للوصول إلى الأنسجة عالية الجودة جنبا إلى جنب مع عدم وجود بروتوكولات موحدة لمعالجة الأنسجة في الدراسات التي تنطوي على الأنسجة البشرية12,13. لذلك من الأهمية بمكان تطوير مناهج جديدة لمجموعات الخلايا الجانبية وتحديد علامات خلوية جديدة داخل التلفيف المسنن (DG) والتي ستؤدي في النهاية إلى فهم أفضل للمساهمات المختلفة لكل نوع من أنواع الخلايا في تنظيم AHN.
لتحقيق ذلك ، أصبح عزل الخلية المفردة (sc) والنوى المفردة (sn) جنبا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي الريبي مفيدا للتحقيق في الأنسجة المعقدة مثل DG14. على هذا النحو ، تم تنفيذ استراتيجيات التخصيب الخلوي لعزل الخلايا المفردة من مكانة الحصين البالغة للفأر في الغالب لفحص NSCs15,16. تم تطبيق استراتيجية مثيرة للاهتمام لإثراء الخلايا غير العصبية من DG عن طريق تسلسل الخلايا المفردة المزدوجة السلبية GluR1 / Cd24 والتي أدت إلى تسلسل 1,408 خلية بدون مجموعات مميزة بين الخلايا النجمية و NSCs بعد التحليل المعلوماتي الحيوي17. قد يكون هذا بسبب الهضم الأنزيمي القاسي المطلوب لإعداد خلية واحدة يضر بسلامة الخلية والحمض النووي الريبي. لتجاوز هذه المشكلة الفنية ، تم تطوير عدة طرق تستخدم عزل النواة المفردة بدلا من ذلك وهي مناسبة بشكل خاص للأنسجة المعقدة11,18. ومع ذلك ، فإن غلبة الخلايا العصبية داخل DG أو على نطاق أوسع داخل نظام الحصين والأنف والأذن والحنجرة يولد تحيزا في أخذ العينات لدراسة كامل مجموعات الخلايا الموجودة داخل مناطق الدماغ هذه. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العدد المحدود من الخلايا التي سيتم تحميلها لإعداد مكتبات الخلية المفردة يبرز وجود مجموعة الخلايا الرئيسية في خطوط الأنابيب التحليلية للنوى المفردة المتتابعة. في الواقع ، غالبا ما يتم شرح مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة وتحليلها بينما يتم تمثيل مجموعات الخلايا الأخرى تمثيلا ناقصا أو تفويتها 5,11.
في محاولة للتغلب على هذه التحيزات والقدرة على تحديد أنواع الخلايا بخلاف الخلايا العصبية الموجودة في الفأر DG ، تم ابتكار طريقة في هذه الدراسة باستخدام مبدأ فرز النوى المنشطة الفلورية (FANS)18 الذي يستبعد معظم مجموعات الخلايا العصبية عن طريق الاختيار السلبي للنوى المفردة الملطخة مع المستضد النووي العصبي (NeuN, المعروف أيضا باسم Rbfox3). تم توجيه هذا الاختيار للمستضد من خلال الأدبيات التي تصف NeuN كعلامة عصبية موثوقة19 وضرورة استخدام بروتين نووي لهذا النهج. ثم تم تحضير الخلايا المصنفة من قبل FACS سلبية NeuN لتسلسل الحمض النووي الريبي على منصة الجينوم 10x. تظهر النتائج أن استبعاد الخلايا المعبرة عن NeuN يسمح بتنميط نسخي عالي الجودة من نوع الخلية لمجموعات الخلايا الدبقية والنادرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح ، يعد تشريح DG الخطوة الحاسمة الأولى ، والتي تتطلب بعض الممارسة لإبقائه غير تالف والحد من التلوث من الأنسجة المحيطة. من التجربة ، يمكن الحصول على فصل DG عن الحصين بسرعة كبيرة من قبل باحث ماهر يمكنه بعد ذلك العمل على تحسين تقنيته لزيادة سرعة التشريح وبالتالي تحسين نضارة الأنسجة لتوليد بيانات عالية الجودة. وعلى نفس المنوال ، يتطلب تحضير وإعادة تعليق النوى المفردة الاتساق عبر الظروف المختلفة المستخدمة في تجربة واحدة ، ولكن أيضا تجنب السحب المفرط الذي يمكن أن يعطل الغشاء النووي الذي يطلق الحمض النووي الريبي المحيط الذي سيؤدي إلى تحيز نتائج التسلسل. بالإضافة إلى التوصيات المذكورة سابقا لإعداد نوى عالية الجودة ، يجب أيضا النظر في تركيز معلق النواة المفردة قبل الشروع في التسلسل. في الواقع ، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ، يجب تخفيف المستحضر بتركيز أعلى من 1200 nuc / μL ، لأن هذا المستوى من تركيز النوى سيكون أكثر عرضة لتشكيل مضاعفات تؤثر على تحليلات المعلوماتية الحيوية النهائية. وتجدر الإشارة إلى أن تسلسل العينات بتركيزات نوى أقل من 500 نيومتر مكعب / ميكرولتر قد لا يكون مجديا بسبب التكلفة المتضمنة. يوصى أيضا باتباع نصيحة مستخدم متقدم لنظام مراقبة الأصول الميدانية لإعداد جميع البوابات والبقاء متسقا مع الإعدادات عبر العينات والتكرارات البيولوجية. وبالمثل ، فإن إعداد المكتبات لتسلسل الحمض النووي الريبي يستلزم بعض التدريب لتحقيق نتائج عالية الجودة ومعظم البائعين لديهم دعم ممتاز لتحقيق ذلك بكفاءة. تم اختبار هذه الطريقة فقط مع الأنسجة الطازجة في هذه الدراسة. ومع ذلك ، تم إجراء FANS أيضا مع الأنسجة المجمدة25. لذلك من المعقول أن نفترض أن هذا البروتوكول يمكن إجراؤه باستخدام الأنسجة المجمدة وإن كان ذلك مع تحسين طفيف.
تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع تطبيق معين في المصب في الاعتبار ، وهو التحقيق في مجموعات الخلايا بخلاف الخلايا العصبية داخل مكانة الحصين العصبية. في الواقع ، تشير خطوط الأدلة المتزايدة إلى أن ضعف AHN في الشيخوخة يمكن أن يعزى إلى الخلايا المحيطة داخل الكوة1،2،3،9. على وجه الخصوص ، تظهر الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن كمنظم رئيسي ل AHN. ومع ذلك ، فإن عزلهم عن DG إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي قد أدى إلى نتائج مختلطة ، مما يجعل هذه الفرضية صعبة التقييم باستخدام هذه التقنية 1,17. سمح هذا النهج لفرز نوى NeuN السلبية FACS بعزل المزيد من الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن مقارنة بالعينات التي لم يتم فرزها بواسطة FACS ، مما يتيح تحليلا معلوماتيا حيويا أفضل. هذا البروتوكول قابل للتطبيق في جميع الأعمار عبر العمر ، وتوفر البيانات التمثيلية المقدمة هنا مع أنسجة من الحيوانات القديمة دليلا على مفهوم أن هذه الطريقة قوية للتحقيق في مكانة الحصين العصبية الهرمة. لتوسيع استخدام هذه الطريقة وتكييفها مع الأسئلة البيولوجية المختلفة ، من المهم مراعاة أنه يمكن اختبار مستضدات الغشاء النووي العصبي الأخرى مع معايرة شاملة لأفضل الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها لهذه العلامات. على سبيل المثال ، عند دراسة عملية التمايز العصبي من NSCs في DG ، تبدأ بعض أنواع الخلايا مثل خلايا النوع 2 أو الخلايا العصبية في التعبير عن NeuN (الشكل التكميلي 3). ومن ثم، ستكون هناك حاجة إلى مولد ضد آخر لدراسة هذه الأنواع من الخلايا على وجه التحديد. على العكس من ذلك ، لا يزال يتم تحديد بعض الخلايا العصبية في هذه الدراسة بعد فرز FACS السلبي ل NeuN ربما بسبب انخفاض أو عدم وجود تعبير عن NeuN في هذه المجموعات السكانية (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية القشرية Cajal-Retzius19). بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن NeuN في مجموعات فرعية من oligodendrocytes26 ، والتي يمكن أن تعطي نتائج متحيزة إذا كانت هذه المجموعات الفرعية ذات أهمية. وبالتالي ، ينبغي النظر بعناية في اختيار المستضد عند البدء في استخدام FANS لتجنب إدراج أو استبعاد مجموعات الخلايا التي من شأنها أن تحول دون إجابة دقيقة على سؤال بيولوجي محدد. بالاتفاق مع هذا ، يوصى أيضا بالتحقق من صحة كل نتيجة تسلسل من خلال المقايسات المتعامدة (على سبيل المثال ، الكيمياء المناعية أو نطاق الحمض النووي الريبي) قبل التحقق من صحة أو دحض الفرضية المختبرة باستخدام هذا البروتوكول. أخيرا ، يمكن تطوير الخطوة التي تتضمن FANS لتشمل أكثر من جسم مضاد واحد مع استراتيجية فرز أكثر تفصيلا لاستبعاد و / أو تضمين مجموعات الخلايا المرغوبة.
في نهاية المطاف ، يمكن أن يكون للتكنولوجيات الموصوفة في هذا البروتوكول بعض القيود عند استخدامها مع الأنواع الأخرى. على سبيل المثال ، يتم تعريف المكانة بشكل جيد للغاية في القوارض مع وجود NSCs التكاثري والهادئ أو الخلايا العصبية المولودة حديثا المقيدة داخل مناطق فرعية محددة من DG ، ولكن لا يزال من غير الواضح كيف يجب تحديد مكانة الحصين العصبية في الأنواع الأخرى. في الواقع ، لا يتم محاذاة الخلايا التكاثرية داخل منطقة متصلة من DG في الرئيسيات غير البشرية والبشر ولكنها منتشرة حولها وقد تكون موجودة أيضا في اللوزة7. لذلك ، فإن تشريح وعزل مناطق أوسع من DG في الأنواع الأخرى من المحتمل أن يؤثر على استخدام هذا البروتوكول. على وجه الخصوص ، يجب تحسين خطوات التفكك والتثليج لإعداد الأنسجة أثناء العمل مع قطع أكبر من الأنسجة27,28. فيما يتعلق بالتحليل المعلوماتي الحيوي ، في حين أن القوارض التي تحتوي على سلالات متجانسة للغاية ومشروحة جيدا ، فإن التباين الجيني للجينوم البشري جنبا إلى جنب مع الأعداد غير الكافية من العلامات الخلوية للتمييز بوضوح بين مجموعات الخلايا المختلفة (على سبيل المثال ، NSCs والخلايا النجمية) يتطلب الكثير من التطبيع للتحليل الذي يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات مختلفة عند تحديد مجموعة صغيرة من الخلايا7 ، 11. في مثل هذه الحالات ، قد يظل إثراء الخلايا خيارا مفضلا أو يجب استخدامه جنبا إلى جنب مع استراتيجيات أخرى لزيادة القوة التحليلية.
ومع ذلك ، يمكن للنهج الحالي أن يتيح التحقيق في دور مجموعات الخلايا غير المدروسة وإن كانت مهمة في تنظيم AHN. يمكن أن يكون هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة لمجموعات الخلايا النجمية ، التي تلعب دورا مركزيا في ظهور وتطور الأمراض التنكسية العصبية29,30. أظهرت هذه الدراسة أنه يمكن تحديد الخلايا النجمية وغيرها من مجموعات الخلايا النادرة وتوصيفها ببساطة عن طريق استبعاد الغالبية العظمى من الخلايا العصبية الموجودة داخل DG. لم تتمكن الدراسات الأخرى التي تستخدم مناهج مختلفة من تحقيق استرداد مماثل للنوى من نفس النطاق من مجموعات الخلايا5،11،17. علاوة على ذلك ، تظهر نتائج هذه الدراسة أنه من الممكن استخدام هذا النهج لعزل مجموعة NSC دون إثراء محدد لمجتمع الخليةهذا 15.
في الختام ، سيكون اتباع هذه الطريقة وتحسينها خطوة إلى الأمام لمعالجة الأسئلة المعلقة المتعلقة بالدور السياقي للمكانة العصبية الحصينية لتعديل AHN. على وجه الخصوص ، يمكن أن يجلب رؤى جديدة حول مستويات التعبير الجيني في الأدمغة المسنة والمريضة في مجموعات الخلايا المرتبطة بتنظيم AHN9 ، أو يدعم تحديد عدم التجانس المحتمل ل NSCs1 أو يعالج دور الأوعية الدموية في AHN. في النهاية ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع منافذ الخلايا الجذعية البالغة الأخرى ذات الأسئلة والقضايا المماثلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا لاكلان هاريس وبييرو ريغو على الدعم الفني وجيسون إم أوسلانر وديت لوفات على تقديم ملاحظاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال دعم المنح من MRC والتعاون البحثي قبل المنافسة مع MSD ، ومعهد فرانسيس كريك ، الذي يتلقى تمويله من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (FC0010089) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC0010089) ، و Wellcome Trust (FC0010089) وجائزة Wellcome Trust Investigator Award إلى FG (106187 / Z / 14 / Z). نعتذر للعديد من المؤلفين الذين لم نتمكن من مناقشة أعمالهم والاستشهاد بها بسبب ضيق المساحة.
Materials
| 0.5ml microtube | Eppendorf | 30124537 | |
| 10.00µm Flouresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 15700-10 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 pairs of sterile Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma Aldrich | D9564-10MG | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | N/A | |
| 5 mL round bottom high clarity polypropylene test tube with snap cap | Falcon | 352063 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Falcon | 352235 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 8 peak SPHERO Rainbow Calibration Particles | BD Biosciences | RCP-30-5A | |
| Accudrop Beads | BD Biosciences | N/A | |
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | |
| Anti-NeuN antibody, clone A60, Alexa Fluor 488 conjugated | Millipore | MAB377X | |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| Beckman Coulter MoFlo XDP | Beckman Coulter | N/A | |
| Chromium Controller | 10x Genomics | N/A | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213 | |
| BSA 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Dounce tissue grinder set: mortar, loose pestle (A) and tight pestle (B) | KIMBLE | D8938-1SET | |
| Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml | Eppendorf | 30108116 | |
| Halt, 100x Protease inhibitor | ThermoFisher | 78429 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | N/A | Sequencing configuration: 28-8-0-91 |
| KCl | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| LUNA-FX7 Automated Cell counter | Logos Biosystems | N/A | |
| MgCl2 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| N°10 guarded sterile disposable scalpels | Swann-Morton | 6601 | |
| Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502-1L | |
| Pair of sterile student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| PBS | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| RNase Inhibitor 40 U µl-1 | Ambion | AM2684 | |
| RNasin 40 U µl-1 | Promega | N211A | |
| Sterile Petri dish | Corning | 430167 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 59378-500G | |
| Tris buffer, pH 8.0 | Any chemical supplier | Laboratory made | |
| Triton X-100 10% (v/v) | Sigma Aldrich | T8787-250ML | |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 |
References
- Gillotin, S. Targeting impaired adult hippocampal neurogenesis in ageing leveraging intrinsic mechanisms regulating neural stem cell activity. Ageing Research Reviews. 71, 101447 (2021).
- Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
- Hanspal, M. A., Gillotin, S. A new age in understanding adult hippocampal neurogenesis in Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 17 (12), 2615-2618 (2022).
- Zhang, H., et al. Single-nucleus transcriptomic landscape of primate hippocampal aging. Protein & Cell. 12 (9), 695-716 (2021).
- Franjic, D., et al. Transcriptomic taxonomy and neurogenic trajectories of adult human, macaque, and pig hippocampal and entorhinal cells. Neuron. 110 (3), 452-469 (2022).
- Moreno-Jimenez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-Garcia, M., Rabano, A., Llorens-Martin, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2541-2553 (2021).
- Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. Journal of Neuroscience. 41 (12), 2554-2565 (2021).
- Zhou, Y., et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature. 607, 527-533 (2022).
- Bonafina, A., Paratcha, G., Ledda, F. Deciphering new players in the neurogenic adult hippocampal niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 548 (2020).
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Flor-Garcia, M., et al. Unraveling human adult hippocampal neurogenesis. Nature Protocols. 15 (2), 668-693 (2020).
- Moreno-Jimenez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Kalinina, A., Lagace, D. Single-cell and single-nucleus RNAseq analysis of adult neurogenesis. Cells. 11 (10), 1633 (2022).
- Harris, L., et al. Coordinated changes in cellular behavior ensure the lifelong maintenance of the hippocampal stem cell population. Cell Stem Cell. 28 (5), 863-876 (2021).
- Shin, J., et al. Single-cell RNA-seq with Waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Artegiani, B., et al. A single-cell RNA sequencing study reveals cellular and molecular dynamics of the hippocampal neurogenic niche. Cell Reports. 21 (11), 3271-3284 (2017).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nature Protocols. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Sarnat, H. B., Nochlin, D., Born, D. E. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system. Brain Development. 20 (2), 88-94 (1998).
- . Guidance on the Operation of ASPA Available from: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_dat/file/662364/Guidance_on_the_Operation_of_ASPA.pdf (2022)
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (33), e1543 (2009).
- Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer’s disease and aging. Nature Neuroscience. 23 (6), 701-706 (2020).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38 (6), 737-746 (2020).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Mussa, Z., Tome-Garcia, J., Jiang, Y., Akbarian, S., Tsankova, N. M. Isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting. Journal of Visualized Experiments. (170), e62405 (2021).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Marti-Mengual, U., Varea, E., Crespo, C., Blasco-Ibanez, J. M., Nacher, J. Cells expressing markers of immature neurons in the amygdala of adult humans. European Journal of Neuroscience. 37 (1), 10-22 (2013).
- Zhang, X. M., et al. Doublecortin-expressing cells persist in the associative cerebral cortex and amygdala in aged nonhuman primates. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 17 (2009).
- Ding, Z. B., et al. Astrocytes: a double-edged sword in neurodegenerative diseases. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1702-1710 (2021).
- Phatnani, H., Maniatis, T. Astrocytes in neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (6), 020628 (2015).
