ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

注:この研究で使用されたhiPSC-CMは、前述のhiPSC培養およびCM分化プロトコルに従って生成されました26,27。オプションで、cisプロトコルを開始する前に、hiPSC-CMを拡張して最近公開した凍結保存することができます(セクション4)10。 1. 細胞培養培地、溶液、アリコートの調製 基礎培地を準備するペニシリン-ストレプトマイシンと培地(RPMI 1640)を室温(RT)に平衡化し、完全に解凍されていることを確認します。500 mLの培地と5 mLのペン/連鎖球菌を混合します。4°Cで最大8週間保管します。使用前に37°Cに平衡化してください。 RPMI + B27を準備するB27サプリメントと基礎培地をRTに平衡化します。 サプリメントを完全に解凍してください。490 mLの基礎培地と10 mLの50x B27サプリメントを混合します。4°Cで最大2週間保管します。使用前に37°Cに平衡化してください。 hiPSC-CM再めっき培地の準備プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(最終濃度2 μM)および10%ノックアウト血清置換(KSR)を含むRho関連コイルドコイルをRPMI + B27培地に追加します。必要に応じて、ROCK阻害剤をRM培地に直接添加します。一度補充した培地は保管しないでください。 CM解凍メディアを準備する1:100濃度の細胞生存サプリメント(レビタセルなど)と20%KSRをRPMI + B27培地に加え、使用前に37°Cに平衡化します。 成熟サプリメントを準備する前述の成熟培地式28 は、3 mMグルコース、10 mM L-乳酸塩、5 mg/mLビタミンB12、0.82 mMビオチン、5 mMクレアチン一水和物、2 mMタウリン、2 mM L-カルニチン、0.5 mMアスコルビン酸、1x NEAA、0.5%(w / v)アルブマックス、1x B27、および1%KOSRで構成されています。成熟サプリメントのフルボトル(500 mL)を1本調製するには、グルコースを含まないDMEMのボトルから65 mLを取り出し、2.7 gのグルコース、5.6 gのL-乳酸塩、0.025 mgのビタミンB12、1 mgのビオチン、3.73 gのクレアチン一水和物、1.25 gのタウリン、1.975 gのL-カルニチン、0.7125 gのアスコルビン酸、 50 mLのNEAA、12.5 gのアルブマックス、および5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン。 0.22 μmの細孔ポリエーテルスルホン(PES)メンブレンを備えた滅菌使い捨てフィルターユニットでろ過します。 45 mL(500 mLの成熟培地を調製するため)または4.5 mL(50 mLの成熟培地を調製するため)に分注します。20°Cで最大6か月間保管してください。 成熟培地を準備するB27サプリメント、ノックアウトSR、ペニシリン-ストレプトマイシン、成熟サプリメント28、およびDMEM非グルコース培地をRTで平衡化します。 サプリメントを完全に解凍してください。435 mLのDMEM無グルコース培地を10 mLの50x B27サプリメント、5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン、5 mLのノックアウトSR、および45 mLの成熟サプリメントと混合します。4°Cで最大2週間保管します。使用前に37°Cで平衡化してください。 蛍光光輝培地を準備するRTでペニシリン-ストレプトマイシンとDMEMフルオロブライト培地を平衡化します。 サプリメントが完全に解凍されていることを確認してください。500 mLのDMEM蛍石培地を5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンと混合します。4°Cで最大1ヶ月間保管してください。使用前に37°Cで平衡化してください。 非イオン性洗剤溶液を準備する20%w / v非イオン性洗剤粉末(F-127など)をPBSと混合します。0.22 μmフィルターを使用してろ過し、4°Cで最大6か月間保管します。使用前にRTで平衡化してください。 カルシウム染料培地の調製非イオン性洗剤溶液(最終濃度0.04%v / v)と0.1倍のカルシウム染料(Cal520 AMなど)を蛍光明るい媒体に混合します。50 mLのコニカルチューブに、10 μLのCal520と20 μLの非イオン性洗剤溶液を加えます。完全に溶解するまで混合する。細胞に加える前に溶液を暗所に保管してください。 2. バッファーの調製 透過処理およびブロッキングバッファーの調製:このバッファーには、10 mL の PBS、5% wt/v BSA、および 0.3% v/v Triton-X-100 が含まれています。 フローサイトメトリーバッファーの調製:このバッファーには、50 mL の PBS、1% wt/v BSA、および 0.3% v/v Triton-X-100 が含まれています。 フローサイトメトリー洗浄バッファー:このバッファーには、50 mLのPBSと1%wt/v BSAが含まれています。 スフェロイド洗浄バッファー(SWB):このバッファーには、1 mLのTriton-X-100、2 mLの10%(DPBSではw / v)SDS、および1 LのPBS中に2 gのBSAが含まれています。注意: SWBは4°Cで最大2週間保存できます。 包埋溶液(ES)の調製:100 mLの包埋溶液を調製するには、50 mLのグリセロールを9.09 mLのdH2O、1 mLのトリス緩衝液(1 M、pH 8.0)、および200 μLのEDTA(0.5 M)と混合します。フルクトース22.7 gを加え、暗所で溶解するまでRTで混合します。透明になったら、フルクトース22.2 gを加え、溶解するまで混ぜます。次に尿素15 gを加え、溶解するまで混合します(暗所で4°Cで保存します)。 PBT(トゥイーン-20を含むPBS)バッファーを準備します。このバッファーには、PBS/トゥイーン-20 (0.1% v/v) が含まれています。1 LのPBSに対して、1 mLのTween-20を加えます。 3. 低分子の調製 チアゾビビン(ROCK阻害剤)粉末をDMSO溶液50 μLの10 mMアリコートで再構成し、-20°Cで最大6か月間保存します。光から保護してください。 Cal-520 AMをそれぞれ10 μLずつ2.5 mMのアリコートをDMSOで調製し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。光から保護してください。 4. 心臓スフェロイドの生成 注:大量のCSの場合は、2 mLのhiPSC-CM再めっき培地を含む6ウェル超低アタッチメントプレートに最大100万CMをシードします。この研究では、96ウェルプレートのウェルあたり最低2,500(2.5k CS)から最大20,000(20k CS)のhiPSC-CMを使用しました。 1枚の96ウェルプレートに対して、最低2 x 106 個のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)10を含む細胞培養液を調製します。 培養したhiPSC-CMがコンフルエントに達したら、0.1 mL/cm2 の滅菌心臓剥離溶液(トライプルなど)を各ウェルに加えます。プレートを37°Cで15分間インキュベートします。 5 mLのピペットを使用して、2 mLの温かい基礎培地で洗い流すことで細胞を機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を作製します。明視野顕微鏡(倍率4倍)で剥離を確認します。細胞は白く見え、丸い形をします。 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、300 x gで3分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞を1 mLのhiPSC-CM再プレーティング培地に再懸濁します。 1,000 μLのピペットチップを使用して、細胞ペレットを機械的に解離します。溶液は、3回または4回混合した後に均質に見える。セルを数えます。100 μLの再プレーティング培地中の適量の細胞を各超低付着丸底96ウェルに移します。 CSのプレートをインキュベーター内の70rpmのオービタルシェーカーに24時間置きます。インキュベーターの条件を37°C、5%CO2、21%O2、および90%湿度に設定します。 各ウェルから50 μLの培地を吸引し、最初の48時間、ウェルあたり100 μLのRPMI + B27培地を加えます。注:偶発的な吸引や回転楕円体の破裂を防ぐために、常に50 μLの培地を96ウェルプレートに保管してください。 各ウェルから100 μLの培地を吸引し、ウェルあたり100 μLの成熟培地を追加します。成熟培地中の細胞を維持し、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。 5. CSの凍結保存 注意: CSは長期保存のために凍結保存できます。CSは、CSの生成後3日目から実施でき、CSは96ウェルプレートのウェルで直接凍結保存することも、クライオバイアルのCS懸濁液として凍結保存することもできます。 プレートを氷の上に10分間置き、プレートを予冷します。 回転楕円体プレートを70 x gで3分間遠心分離します。 50 μLが残るまで上清を除去し、ウェルあたり200 μLの氷冷hiPSC凍結培地を加えます。注意: CSサスペンションは、手順の全期間にわたって氷上に置いてください。スフェロイドを含む6ウェルプレートの場合は、1つのウェルを500 μL凍結培地クライオバイアルで凍結します。 プレートシールフィルムでプレートをシールします。注意: 96ウェルプレートはポリスチレンボックスに保管するか、利用できない場合は、手順5.5.1の説明に従ってシリコンモールドを作成できます。 ウェルプレートと冷凍庫の間の均一な熱交換を確実にするために、プレートをポリスチレンボックスまたはシリコンモールドに慎重に配置します。シリコンモールドを準備するには:シリコンエラストマーキットの2つのコンポーネントを10:1の比率で激しく混合します。真空ポンプを使用して15〜20分間溶液を脱泡します。続いて、溶液をウェルプレートの底部の内側にキャストし、真空ポンプを使用して10分間気泡除去します。金型をオーブンに入れ、60°Cで8時間硬化させて、プレートを剥離した半可撓性エラストマーを得た。 プレートを-80°Cでポリスチレンボックスまたは準備したシリコンモールドで最低4時間凍結します。 プレートを液体窒素タンクまたは-150°Cの冷凍庫に移して長期保存します。 6. 心臓スフェロイドの融解 注意: 迅速な解凍プロセスを確実にするために、一度に複数のプレートを解凍しないでください。 20 mLの37°C予熱基礎培地を50 mLのコニカルチューブに調製します。 液体窒素からCSを含むセルプレートを収集し、インキュベーターに15分間入れます。インキュベーターの条件を37°C、5%CO2、21%O2、および90%湿度に設定します。 細胞ペレットが残っている上清を除去し、各ウェルを温かい基礎培地に再懸濁する。ウェルあたり200 μLの培地を使用してください。 70 x gで3分間遠心分離します。 手順 6.3 と 6.4 を繰り返します。 細胞ペレットが残るまで上清を除去し、各ウェルに200 μLのCM融解培地を加えます。 CSのプレートをインキュベーター内の70rpmのオービタルシェーカーに24時間置きます。インキュベーターの条件を37°C、5%CO2、21%O2、および90%湿度に設定します。 各ウェルから50 μLの培地を吸引し、最初の48時間、ウェルあたり100 μLのRPMI + B27培地を加えます。 各ウェルから100 μLの培地を吸引し、ウェルあたり100 μLの成熟培地を加えます。成熟培地中の細胞を維持し、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。 7. 細胞内Ca2+ トランジェントの評価 注:CSは合計3週間培養されています。凍結の2週間前、解凍の1週間後。「新鮮な」コントロールは年齢が一致しています。 1週間の培養後、解凍したCSはカルシウム処理光学イメージングに最適です。カルシウム色素(Cal520AMなど)を使用して、細胞からのCa2+ の取り込みと放出を評価します。 ウェルあたり100 μLのカルシウム色素培地で処理し、インキュベーター内で60分間インキュベートします。インキュベーターの条件を37°C、5%CO2、21%O2、および90%湿度に設定します。注意: Cal520AMは光に敏感です。すべてのロード手順と実験を暗闇の中で実行してください。 カルシウム取得および分析システムを準備します。顕微鏡に電力を供給し、環境制御オプションがオンになっていることを確認します。 カメラとフレーミングの絞り寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。注:ここでは、ライカサンダーDMi8顕微鏡を使用しました。他の顕微鏡システムも、30フレーム/秒(fps)を超えるサンプリングレートを可能にするまで適用できます。 10秒以内に2〜10ピークの一貫したストリームでビデオを録画し、96ウェルプレートをスキャンし、最初は左に移動し、次にジグザグに下に移動してプレート全体をカバーします。488 nmレーザーを使用してカルシウム信号を測定します。カルシウム放出中の明るい緑色の信号を持つ黒い背景にコントラストを設定します。 Ca2+トランジェントを取得した後、製造元の指示に従って蛍光トレース分析ソフトウェア(CyteSeer、Vala Sciencesなど)でデータを解析します。 8. 解離した心臓スフェロイドのフローサイトメトリー解析 注:この研究では、フローサイトメトリーを使用して、解凍プロセスの前後のCSの生存率を決定しました。 スフェロイド損傷を避けるために、5 mLピペットを使用して15 mLコニカルチューブにCSを収集し、70 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLのPBSを加える。 200 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLの心臓剥離溶液(トライプルなど)を加えてCSを解離します。チューブを37°Cで15分間インキュベートします。 5 mLピペットを使用して、顕微鏡下で観察したときに単一細胞が見えるまで、2 mLの基礎培地でフラッシュすることにより、細胞を機械的に解離させます。 200 x gで3分間遠心分離します。 上清を吸引し、1x PBS中の200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液でCMを固定します。RTで10分間インキュベートします。 200 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLのPBSを加える。注:一時停止ポイント:固定されたhiPSC-CMは、4°Cで最大4週間保存できます。 細胞懸濁液をFACSチューブに移し、200 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、1 x 105 細胞を50 μLの透過処理バッファーに再懸濁します。 細胞を4°Cで30分間インキュベートします。 免疫蛍光フローサイトメトリー分析では、ステップ8.9.1〜8.9.4を実行します。細胞をα-アクチニン抗体を含むフローサイトメトリーバッファー(50 μL)に1:300の希釈率で再懸濁します。別のFACSチューブで、1 x 105 細胞をフローサイトメトリーバッファー(50 μL)に、それぞれのアイソタイプコントロール(例:FITCマウスIgM、κアイソタイプ[1:200希釈])で再懸濁します。同様に、ネガティブコントロールのために、1 x 105 細胞を50 μLのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。 細胞を4°Cで30分間インキュベートします。 2.5 mLのフローサイトメトリーバッファーを加え、細胞を200 x g で4°Cで3分間遠心分離します。上清を捨て、この洗浄ステップを2回繰り返す。 細胞を50 μLのフローサイトメトリーバッファーに、二次抗体ヤギ抗マウス(1:300希釈)で再懸濁します。注:二次抗体溶液は光に敏感であるため、チューブを暗所に置いてください。 ヨウ化プロピジウム(PI)による生存率チェックのために、サンプルあたり150 μLのPI(1:1,000)を加え、15分間インキュベートします。注意: PI溶液は感光性であるため、チューブを暗所に置いてください。 補足図1に示すように、標準的なゲーティング戦略に従ってゲートを調整し、フローサイトメーターで細胞を分析します。 9. 全3次元スフェロイドの免疫蛍光染色 注:このプロトコルは、免疫蛍光標識によるオルガノイド全体の高解像度3Dイメージングのためのプロトコルに基づいており、以前に公開されており29 、心臓スフェロイド用に調整されています。手順中、すべてのピペットチップとコニカルチューブを1%wt/v BSA-PBSでコーティングして、スフェロイドがプラスチックに付着するのを防ぐことができます。材料をコーティングするには、1%BSA-PBSに浸します。機械的破壊を避けるために、5 mLピペットを使用してスフェロイドを損傷しないように注意してください。 5 mL ピペットで 15 mL コーティングされたチューブに CS を回収します。回転楕円体は目に見える。抗体の組み合わせごとに~20-50個のスフェロイドを収集します。70 x g で3分間遠心分離し、上清を吸引します。 コーティングされた1 mLチップを使用して、1 mLの氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液中の1x PBS溶液にスフェロイドを注意深く再懸濁します。 4°Cで45分間固定します。20分後、コーティングされた1 mLチップを使用してスフェロイドを静かに再懸濁します。これにより、すべての回転楕円体の間で固定が均一になります。 10 mLの氷冷PBSをチューブに加え、チューブを反転させて穏やかに混合します。4°Cで10分間インキュベートし、70 x g で3分間スピンダウンします。注意: このステップ以降、固定後にCSがチップに付着しないため、チップとコニカルチューブのコーティングは通常必要ありません。 ペレットを氷冷SWB(ウェルあたり200 μLのSWB)に再懸濁してCSをブロックし、スフェロイドを24ウェル懸濁培養プレートに移します。注:1つの大きなペレットからのCSは、複数のウェルに分割して、異なる染色を行うことができます。抗体の組み合わせごとに~20-50 CSを使用します。 4°Cで少なくとも15分間インキュベートします。 200 μLのSWBを空のウェルに追加して、参照ウェルとして使用します。注:免疫蛍光染色では、48ウェルまたは96ウェルプレートを使用して抗体の使用量を減らすこともできます。ただし、ウェルあたりの体積が小さいため、染色および洗浄の結果を減らすことができます。 プレートを45°の角度で5分間傾けたままにして、スフェロイドをプレートの下部に定着させます。 SWBを取り外し、CSを200 μLのSWBに残します(リファレンスウェルを使用して、200 μLの最小容量を推定します)。 一次抗体を2倍濃縮したSWB200 μL(ɑ-アクチニン[1:200]およびトロポニンT [1:200]など)を加え、揺動/振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします(水平シェーカーで40 rpm)。 翌日、各ウェルに1 mLのSWBを追加します。 プレートを45°の角度で5分間放置することにより、スフェロイドをプレートの下部に沈降させます。 SWBを取り外し、プレートに200μLを残します。1 mLのSWBを加え、ゆっくりと揺れ/振とうしながら2時間洗浄します。 手順 9.12 と 9.13 をさらに 2 回繰り返します。 プレートを45°に5分間傾けたままにして、CSをプレートの下部に沈降させます。SWBを取り外し、各ウェルに200 μLを残します 二次抗体、結合抗体、および2倍濃縮された色素(DAPI [1 μg/mL]、マウス-AF488 [1:500]、ウサギ-AF568 [1:500]など)を含む200 μLのSWBを加え、ゆっくりと揺れ/振とうしながら、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、手順 9.12 と 9.13 をさらに 2 回繰り返します。 CSを慎重に1.5 mLチューブに移し、70 x g で3分間スピンダウンします。 CSを中断することなくピペッティングして、できるだけ多くのSWBを取り外します。 端を切り落とした状態で200 μLのチップを使用して包埋溶液(ES、RTで少なくとも50 μL)を追加し、気泡の形成を防ぐために穏やかに再懸濁し、RTで20分間インキュベートします。 それまでの間、スライドガラスにマニキュアまたはシリコンシーラントを入れた正方形の容器を作成します。 200 μLのチップの端を切り取り、ESのCSを正方形の容器の中央に移します。 正方形のカバーガラスを上に置きます。気泡を減らすには、最初にカバーガラスの片側を置き、次に表面の下に空気が閉じ込められなくなるまでカバーガラスを片側から反対側にゆっくりと下げてから、カバーガラスを解放します。 カバーガラスのすべての端をそっと押して、マニキュアまたはシリコンシーラントにシールします。 スライドをRTで一晩放置します。翌日、スライドはイメージングの準備が整います。注意: ESによる光学的透明化は、組織のわずかな収縮を引き起こす可能性があります。ただし、これはCSの全体的な形態に影響を与えることはできません。染色手順は、スライドを4°C(少なくとも1週間)または-20°C(少なくとも6ヶ月間)で保存することにより、ここで一時停止できます。