アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

この論文に記載されているすべての方法は、ロッテルダムのエラスムス医療センターの倫理研究委員会によって承認されました。プラーク検体採取前に患者からインフォームドコンセントを得た。プロトコルのワークフローチャートを 図1に示します。 1.組織採取、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)イメージング、およびテストサンプルの準備 組織の収集と保管頸動脈内膜剥離手術を受けた同意患者から新鮮なヒト頸動脈アテローム硬化性プラーク標本を収集します。注:この手術から回収されたプラークサンプルは、脂肪の蓄積(脂質プール)と石灰化を含む頸動脈の罹患内膜層で構成されています22。 リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を使用して血液の残留物を取り除き、ガーゼパッドで検体を乾燥させます。 ピンセットを使用して検体を15 mLチューブに入れます。チューブを液体窒素に10分間入れて、組織を急速凍結します。 急速凍結後、μCT撮影当日まで-80°Cの冷凍庫に保存してください。注意: スナップフリーズは結晶形成を最小限に抑え、組織の微細構造損傷を引き起こします。ブタ大動脈組織に関する以前の研究では、-80°Cでの急速凍結および保存は組織の機械的特性に大きな影響を与えないことが示されています23。 μCTイメージングμCT撮影当日、15 mLチューブからプラーク標本を取り出します。組織がチューブに付着している場合は、室温でチューブにPBSを充填します。サンプルをチューブから取り出すことができるまで、組織をPBSのままにします。 プラーク標本をティッシュペーパーで完全に乾かします。 緑色のボタンを押してμCTシステムの電源を入れます。画面下部のCTソフトウェアでウォームアップを押して、15分待ちます。 Cu 0.06 mm + Al 0.5 mmのX線フィルターをμCTシステムに手動で配置します。 画像を保存するフォルダーを選択します。 左側のパネルでパラメータを選択します。ドロップダウンリストを使用して、スキャン時間4分、分解能172μm、電圧90kV、アンペア数88mA、視野86mm、回転360°を選択します。 デバイスのドアを開きます。プラットフォームを手動で引き出します。 パラフィルムをプラットフォームに置き、サンプルをプラットフォーム上(プラットフォームのさらに極端に向かって)に置きます。 プラットフォームを手動でデバイスに配置し、ドアを閉じます。 ライブモード(目のアイコン)をアクティブにします。デバイスの矢印でプラットフォームを移動して、サンプルをFOVの中央に配置します。 イメージングを開始します(中央下のアイコン)。イメージングが終了したら、下部(中止ボタンの下)にあるドアアイコンを押します。 μCTスキャン後、ステップ1.1.3の説明に従って、プラーク標本を再度スナップフリーズします。多光子顕微鏡イメージングと機械的試験の日まで-80°Cで保存してください。 取得したμCTイメージングのDICOMファイルをオープンソースの3Dスライサソフトウェア24で開く。 セグメントエディターに移動します。マスターボリュームとして分析するボリュームの新規セグメンテーションの作成 | を選択します。 [ 追加 ] をクリックしてセグメントを追加します。 名前 と 色 を押して、これらの パラメータを変更します。 セグメントを定義するには、ウィンドウの下部にある effects | しきい値をクリックします。この閾値ツールを使用して、石灰化(>450 HU)組織領域と非石灰化(<450 HU)組織領域を区別します。しきい値を選択したら、下部にある[適用]を押します。 [ 3D の表示 ] ( [追加] のすぐ右側) を押して、3D ビューでセグメンテーションを視覚化します。セグメンテーションの不要な領域がある場合は、 はさみ 効果でそれらを削除します。 セグメンテーションモジュール内のセグメントの不透明度を変更するには、目的のセグメンテーションの名前をクリックします。注:可能であれば、μCTイメージングとμCT画像のレビューは、他のプロトコルと同じ日に実行できます。その場合は、手順 1.2.12 をスキップします。ただし、このプロトコルの後続の手順も時間がかかり、同じ日に実行する必要があることに注意してください。いくつかの練習の後、説明された設定と組織を使用すると、μCTイメージングには~45分、μCT画像のレビューは~15分、単一のテストサンプルのテストサンプルの準備は~1時間、顕微鏡検査は~4時間、一軸引張試験は~2時間かかります。 試験サンプル調製コラーゲンイメージングと機械的テストの日に、室温のPBSに約10分間浸してプラークを解凍します。 手順 1.2.13-1.2.18 で作成したプラークの 3D 構築を 3D スライサー ソフトウェアで開きます。 プラーク組織の自然のランドマークを使用して、3D再構成のどの部分が実際のプラークサンプルに対応するかを特定します。3D再構成のどの領域に石灰化が含まれていないかを特定し、実際のプラークでこの領域を視覚的に識別します。 外科用ハサミとピンセットを使用して、動脈の縦軸に沿ってプラークを切り開きます。手術による切り傷がすでに存在する場合は、組織を最適に使用するためにこの切り傷から始めます。サンプルの形状が管状ではなく、長手方向を定義するのが難しい場合は、サンプルをテストから除外します。 プラーク標本から長方形の試験サンプルを切り取ります。涙や石灰化を含む組織領域を避けながら、テストサンプルができるだけ大きいことを確認してください。試験片の端に小さな裂け目や亀裂があると、引張試験中に既存の亀裂から亀裂が伝播する可能性があるため、この切断中は注意してください。 テストサンプルの幅と長さ(WL)の比率が、引張試験機に取り付けられたゲージ長で<1であることを確認してください。サンプルがこの要件を満たしている場合、境界条件25の観点から適切な引張試験に適しています。注: サンプル寸法の範囲は大きくなる可能性があります。著者らがテストしたサンプルのゲージ長は3.4〜12.9 mm、幅は1.6〜6.4 mmでした。 2. 多光子顕微鏡イメージング 準備コラーゲンイメージングと機械的テストの日の前に、40 gのシリコーンエラストマーベースを2つの50 mLチューブに分け、パスツールピペットを使用して各チューブに2 gの硬化剤を追加します(1:10の比率)。2つの成分をピペットで混ぜます。 チューブを700 × g で1分間遠心分離して、できるだけ多くの気泡を取り除きます。 ペトリ皿(直径10 cm)にシリコンの薄層(約0.5〜1 cm)を入れ、オーブンで65°Cで3時間インキュベートするか、室温で48時間置きます。 プラークテストサンプルを採取し、組織に針を固定して、その両端をシリコンに固定します(図2A)。サンプルの管腔側が上を向いていることを確認してください。機械的試験中に引張試験装置のクランプ内にあるサンプルの領域に針を挿入します。 安全メガネをかけます。サイドカッターを使用して針を短くし、サンプル表面から数ミリメートル未満突き出るようにし、顕微鏡の対物レンズが損傷するのを防ぎます。サンプルが水没するまで、ペトリ皿にPBSを入れます。 顕微鏡のセットアップ多光子顕微鏡に適切な対物レンズが取り付けられていることを確認してください。倍率20倍の赤外光を透過するように最適化された対物レンズを使用してください。 顕微鏡システムを起動します。顕微鏡の操作ソフトウェアを開きます。 イメージングテーブルの初期化を求められたら、顕微鏡コンデンサーアームが押し戻され、対物レンズが最も低い位置にあることを確認してください。 多光子レーザーをアクティブにします。 図3のように、テストサンプルを入れたペトリ皿を対物レンズの下に置きます。レーザー設定を最適化する必要があるため、まだサンプルの上に対物レンズを配置しないようにしてください。さもなければ、レーザー光の可能な高出力は組織への損傷につながるかもしれません。 対物レンズがPBSに少し浸っていることを確認してください。必要に応じて、ピペットを使用してPBSを追加します。 光の波長を880nmに設定します。注:この波長が選択されるのは、使用される2光子システムの中心波長が約440nmであるためです。他の顕微鏡では、別の波長がより適用可能かもしれません。 タイルスキャンと撮影場所の選択多光子レーザーをオフにして、顕微鏡の 明視野 モードをアクティブにします。次に、 ライブスキャン モードをオンにします。 対物レンズがサンプルの上にくるようにステージを配置し、サンプル表面に焦点を合わせます。ライブスキャンモードをオフにします。 [取得]タブの2番目のパネルで、目的のバーをスライドしてズーム倍率を1に変更します。注意: このズーム倍率は、対物レンズの拡大率(20倍)とともに、キャプチャされた画像のサイズ(739 μm x 739 μm)を決定します。 [取得] タブの 2 番目のパネルで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 Hz、ライン平均を 1 に、解像度を画像あたり 128 x 128 ピクセル (ピクセル サイズ ~5.8 μm x 5.8 μm) に変更します。 [取得] タブの最初のパネルでラスター パターン シンボルをクリックし、タイル スキャン パネルが表示されるのを待ちます。 ライブスキャンモードをオンにします。スマートパネルのノブを使用して対物レンズをサンプルの隅に移動し、タイルスキャンパネルのマーク位置記号をクリックします。サンプルの各コーナーでこれを繰り返します。正しく実行すると、イメージング用に選択されたすべてのタイルを含むグリッドがオレンジ色で表示されます。 自動ステッチ機能をオフに切り替えます。 画面の右下隅にある [ 開始 ] をクリックして、サンプル サーフェス全体のタイル スキャンを作成し、サンプル ジオメトリの概要を取得します。注:説明されている設定、組織、および顕微鏡システムに基づいて、サンプル表面全体のタイルスキャンを取得するには~10分かかります。 タイルスキャン後、顕微鏡システムのソフトウェアによって自動的に表示されるタイルスキャンパネルの各タイルの左上隅のx座標とy座標を観察します。スプレッドシートでこれらの座標をメモします。 顕微鏡ソフトウェアのタイルスキャンパネルで、スキャンフィールドと呼ばれるボックスのx方向とy方向のタイルの数を観察します。スプレッドシートのタイル スキャンのサイズをメモします。タイルのサイズ(739μm)を加算/減算して、他のタイルの座標を計算します。注:これらの座標は、SHGイメージングでスキャンするタイルの正確な位置を特定するために必要です。合計イメージング時間が問題にならない場合は、タイルをスキップせずにすべてのタイルをイメージングできます。 タイル スキャンから、SHG イメージングでイメージ化するタイルを選択します。この選択では、クランプ内に入るタイルを避け、 図2Bに示すように、選択した各タイルの間に縦方向と円周方向の両方で1つのタイルを残します。 コラーゲンの可視化:SHGイメージング部屋の照明を消し、顕微鏡ステージを遮光布で覆い、部屋からの光が検出器に到達しないようにします。注意: 検出器に到達する光を最小限に抑えると、画像取得中のノイズが減少します。 多光子(MP)レーザーをオンにします。 430〜450nmのバンドパスフィルターを備えた非デススキャン検出(NDD)検出器を選択します。 手順 2.3.10 で取得した情報を使用して、画像化するタイルの位置を特定します。指定されたボックスに 座標 を入力して Enterキーを押すと、目標が右側のタイルに移動します。 ライブスキャンモードをオンにします。注意: 他の顕微鏡または新しいバージョンの操作ソフトウェアでは、タイルスキャン内の場所への移動を自動的に行うことができます。この場合、各タイルのx座標とy座標をメモし(ステップ2.3.10)、オペレーティングソフトウェアに座標を入力する(ステップ2.4.4)必要はありません。 ビームパス設定の下の上部パネルのスライダーを使用してMPレーザー出力を増やし、大幅な漂白なしで可能な限り最高のレーザー出力を取得します。次に、スマートパネルのノブを使用するか、[ビームパス設定]| [追加チャンネル]で検出器の名前をクリックして、明るい画像を取得しますが、ピクセルは飽和していません。検出器ゲインの標準値は500〜800Vです。 スマートパネルのZ位置ノブを使用して、フォーカスプレーンを調整します。 サンプルの一番上に移動し、zスタックパネル([取得]タブ| 3番目のパネルの下)の矢印をクリックして、zスタックの上部の位置を設定します。 次に、SHG信号が検出されなくなるまでサンプルに焦点を合わせます-これがスタックの終わりです。もう一度、zスタックパネルの矢印をクリックして、この位置を設定します。終了したら、ライブスキャンモードをオフにします。注意: 組織は完全に平らではない場合があります。したがって、組織内の異なる領域の試料表面は、z方向にわずかに異なる位置を有し得る。 [取得] タブの 2 番目のパネルで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 Hz に保ち、ライン平均を 2 に設定し、解像度を画像あたり 512 x 512 ピクセル (ピクセル サイズ ~1.4 μm x 1.4 μm) に設定します。双方向Xスキャンボタンをオンに切り替えます。 zスタックパネルでzステップサイズをクリックし、ボックスに3μmのzステップサイズを入力します。画面の右下隅にある [開始] をクリックして、Z スタックを作成します。完了したら、タイルの座標をファイル名に保存するか、各タイルに独自の番号を付けます (図 2B を参照)。注:説明されている設定、組織、および顕微鏡システムに基づいて、単一のタイルのzスタックの取得には~10〜15分かかります。準備ステップ(ステップ2.4.4-2.4.10)は、この時間見積もりに含まれています。 3.機械的試験 一軸引張試験装置の準備引張試験機の指示に従って、水平引張試験のセットアップ(図4)を使用できるようにします(ソフトウェアの電源を入れる、クランプを取り付ける、ロードセルを取り付けるなど)。 試験サンプルの滑りを最小限に抑えるために、引張試験機のクランプの内面に両面フォームテープ(図4A、B-2)を取り付け、フォームテープの内側にサンドペーパーを取り付けます。最終的に、サンドペーパーはテストサンプルと接触します。 加熱浴(図4A、B-3)を所定の位置に置きます。加熱浴にPBSをクランプの底面の高さまで満たして、サンドペーパーにまだ届かないようにします。 加熱槽の電源をONにし、温度を約37°Cに設定します。 高速度カメラを実験室台などを使用して引張試験装置(図4A-4)の上に取り付け、延長リングを介して焦点距離50mmのレンズをカメラに取り付けます。 クランプに焦点が合っていること、および視野がストレッチ手順全体でサンプルを記録するのに十分な大きさであることを確認してください(FOV幅:サンプル幅±;FOVの長さ:サンプルの長さの±2倍)。 照明システム(図4A-5)を、たとえば実験室のスタンドを使用して、引張試験システムの上に取り付けます。照明システムをオンにし、カメラ画像で観察されるPBS表面に反射がないように光の強度と位置を調整します。 カメラの露出時間とゲインを調整して、鮮明な画像を取得します。 画像取得ソフトウェアを、5.2 MPの解像度で30フレーム/秒でキャプチャするように設定します。注:この高いフレームレートは、後続のDIC解析を実行し、破断挙動を調べるために必要です。 クランプの1つの変位速度を設定して、機械的試験中のグローバルエンジニアリングひずみ速度が組織の in vivo 生理学的ひずみ速度に類似するようにします(プラーク組織26の場合は5%/秒)。 スペックルパターンの生成注:このスペックルパターンプロトコルは、Walshらによる以前の研究に基づいています27。ティッシュペーパーで軽くたたいてサンプルを乾かします。 黒い組織染料をエアブラシの目的のバケツに入れます。 エアブラシをコンプレッサーに接続します。 エアブラシコンプレッサー をオンにし、 圧力 を 25PSIに設定します。 ティッシュにスプレーする前に、紙に最適なスペックルパターンを作成してみてください。白黒比50:5028が満たされるまで数回スプレーします。エアブラシの針を前後に動かしてスペックルパターンの粗さを、スペックルのサイズが高速度カメラ29の3〜5ピクセルのサイズに等しくなるまで調整する。注意: スペックルパターンは2つの異なる目的で使用されます。まず、これらのスペックルの変位は、機械的試験中に取得された高速度カメラ画像を比較することによって測定されます(DIC、ステップ4.2)。第2に、このスペックルパターンを使用して、サンプルの未変形状態の画像上の破裂位置を特定する(ステップ4.3.1)。 エアブラシを試験サンプルから約30cm離して持ち、管腔表面にスプレーします。 サンプルをPBSに沈める前に、室温で1分間色素をサンプルに結合させます。 一軸引張試験サンプルを引張試験機のクランプに置き、サンプルの周方向を引張延伸方向に揃え、サンプルの管腔側を上向きにします。ストリップのWL比が<1になるように初期ゲージ長が設定されていることを確認してください。 トルクドライバーを使用して20cNmのトルクを加えて、グリップのネジを締めます。最終的なトルクを適用する前に、各ネジに小さなトルクを適用して、これを徐々に行います。 サンプルにテストに影響を与える可能性のある裂け目が含まれているかどうかを目視検査します。 サンプルが水没するまでさらにPBSを加熱浴に導入し、PBSの温度が再び37°Cに達するまで待ちます。 テストサンプルと定規が基準として含まれている高速度カメラでキャリブレーション画像を取得します。定規がカメラ対物レンズからサンプルの管腔面と同じ距離にあることを確認してください。 ロードセルを風袋引きし、ロードセルと引張試験機のアクチュエータからのグローバルな力と変位の測定値の記録を開始します。 サンプルのたるみを取り除くために、0.05 Nのプレストレッチを適用してサンプルをまっすぐにします。プレストレッチの適用後のアクチュエータによるゲージ長測定に基づいて、最大10%のひずみのプレコンディショニングを10サイクル実行します。 高速度カメラでサンプルの変形のビデオを記録しながら、サンプルが完全に破損するまで一軸引張試験を開始します。組織破壊後、グローバルな力と変位の測定値の記録を停止します。注意: 一部の市販の引張試験機は、手順3.3.6〜3.3.9を自動的に実行できます。現在のプロトコルでは、この自動オプションが使用されている引張試験機に含まれていない場合に実行する手動手順について説明しています。 引張試験装置から試験サンプルを取り出し、適切に廃棄します。 次のサンプルをテストするときは、クランプのサンドペーパーとフォームテープを交換してください。 4.データ分析 コラーゲン組織分析ImageJ で SHG を使用した MPM 中に取得した Z スタックを開き、各 Z スタックの最大強度投影 (MIP) を作成します。 オープンソースのMATLABベースのFOA(繊維配向解析)ツール30を用いて各MIPを分析し、タイル中に存在する個々のコラーゲン繊維の配向角を測定する。次のパラメータを使用します:スケール:容器の直径に応じて[3 4 5]または[2 4 6]、およびSHG信号の強度に応じて血管性のしきい値:0.999、0.9995、または0.9999。注意: このツールの使用方法の詳細については、ソフトウェアのマニュアル31を参照してください。 別のオープンソースの MATLAB ベースのツールである FibLab32 を使用して、ガウス分布を角度分布ヒストグラムに適合させます。注意: このツールの使用方法の詳細については、ソフトウェアのマニュアル32を参照してください。 FibLabを使用して得られたガウス分布プロットから、MATLABのワークスペースから次の構造パラメータを抽出します:分布のモードである優勢な繊維角(μ p)、繊維角分布の標準偏差(σp)、および異方性分率(Pani = 1 − Piso)。注:等方性分率はガウス分布のベースラインの下の面積であり、異方性分率にはそのベースライン33の上にあるピークの面積が含まれます。σ p とPani はどちらも、タイル領域における繊維の配向の分散に関する情報を提供します。 目視検査では、方向線を使用してμ pをプロットし、カラーマップを使用してpとPaniσします。 デジタル画像解析と破断解析カメラ画像の目視検査を実行して、破裂開始が発生したフレームを特定します。このフレームで、破裂位置を視覚的に識別します。 カメラ画像の目視検査を実行して、機械的テストの開始時に破裂した場所で最終的な亀裂や裂け目を特定します。そのような裂け目が存在する場合は、サンプルを分析から除外します。 オープンソースのMATLABベースのソフトウェアNcorr(v1.2)34を使用してDIC分析を実行します。Ncorrマニュアル35の手順に従ってください。引張試験時に記録したカメラ映像をDIC用高速度カメラで使用します。最終延伸前の最終フレームを失敗まで(プリコンディショニング後)参照 画像として選択します。現在の画像では、最後のストレッチの開始から、破断開始が発生したフレームの前の最後のフレームまでのすべての 画像を選択します。 関心領域(ROI)としてサンプル表面を選択します。クランプに近い領域(約1 mm)は、グリップの影響を強く受けるため、これらの領域を除外します。 次のパラメータを使用して DIC 解析を実行します。 サブセット半径: 30 ピクセル;サブセット間隔:3ピクセル。イテレーションカットオフ:50;差分ベクトルカットオフのノルム:10-5;ひずみ半径:5;自動伝播、ステップ #: 5. Ncorrを使用したDIC分析から、ROIのグリーン-ラグランジュ(またはオイラーひずみ)分布を取得します。これらのひずみ分布を使用して、破断前の最後のフレームにおけるプラークサンプル表面全体の平均グリーン-ラグランジュひずみを計算します。破断位置でのグリーン-ラグランジュひずみを計算します。 破裂位置における構造データと機械データの相関テストサンプルの自然のランドマークとテストサンプルに適用されたスペックルを使用して、参照画像上の破裂場所(ステップ4.2.1で特定)を特定します(ステップ4.2.3.1)。 テストサンプルの自然のランドマークを使用して、参照画像とタイルスキャンのオーバーレイを作成し(ステップ2.3)、タイルスキャンの破裂位置を特定します。破裂が発生した MPM-SHG タイルを特定します。MPM-SHGでスキャンしたタイルに破裂がない場合は、破裂位置に最も近いタイルを特定します。破断が発生したタイルで見つかった構造パラメータを取得します。