JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

שיטה לחקר הקשר בין מבנה הקולגן המקומי לבין התכונות המכניות של רובד טרשתי ברקמה סיבית

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64334
, , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering,Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center,Erasmus Medical Center

Summary

פיתחנו צינור הדמיה מכנו כדי לחקור את תכונות הרובד הטרשתי ההטרוגני, המבני והמכני. צינור זה מאפשר התאמה של הזווית המקומית הדומיננטית ופיזור כיוון סיבי הקולגן, התנהגות הקרע וטביעות האצבע המאמץ של רקמת הרובד הסיבי.

Abstract

קרע של פלאקים טרשת עורקים בעורקים הכליליים והעורקים התרדמה הוא הגורם העיקרי לאירועים קרדיווסקולריים קטלניים. עם זאת, מכניקת הקרע של רקמת הרובד ההטרוגנית, הקולגן מאוד, וכיצד זה קשור למבנה הסיבי של הרקמה, עדיין לא ידועים. צינורות קיימים לחקר מכניקת הפלאק מוגבלים להשגת מאפיינים מכניים גולמיים בלבד של רקמת הרובד, בהתבסס על ההנחה של הומוגניות מבנית של הרקמה. עם זאת, רקמת רובד סיבי היא הטרוגנית מבחינה מבנית, ניתן לטעון בעיקר בשל שונות מקומית בארכיטקטורה של סיבי קולגן.

צינור ההדמיה המכנו-הדמיה המתואר כאן פותח כדי לחקור את תכונות הרובד המבני והמכני ההטרוגניות. בצנרת זו, ארכיטקטורת הקולגן המקומית של הרקמה מאופיינת באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון (MPM) עם דור הרמוני שני (SHG), והתנהגות הכשל של הרקמה מאופיינת בתנאי בדיקת מתיחה חד צירית באמצעות ניתוח מתאם תמונה דיגיטלי (DIC). צינור ניסויי זה מאפשר התאמה של הזווית המקומית השלטת ופיזור כיוון סיבי הקולגן, התנהגות הקרע וטביעות האצבע המאמץ של רקמת הרובד הסיבי. הידע המתקבל הוא המפתח להבנה, חיזוי ומניעה טובים יותר של אירועי קרע רובד טרשתי.

Introduction

שבץ איסכמי, הנגרם לעיתים קרובות על ידי קרע ברובד טרשתי בעורקי התרדמה, הוא אחד הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם1. עם זאת, אסטרטגיות תכנון הטיפול הניתוחי הנוכחיות למניעת שבץ הקשור לטרשת עורקים אינן כוללות הערכת סיכון לקרע פלאק2. הסיבה העיקרית לכך היא שסמנים ביולוגיים בסיכון שהוצעו בעבר, כגון עובי מכסה פלאק3 וגודל ליבת שומנים4, הוכחו כבעלי ערך ניבוי לא אופטימלי לאירועים קליניים עתידיים 5,6. הבנה טובה יותר של מכניקת הפלאק ומנגנוני הקרע נחוצה כדי לייעל את הערכת הסיכון לקרע פלאק ולזהות סמני סיכון חדשים של רבדים טרשתיים.

קרע פלאק הוא אירוע מכני מקומי שבו רקמת הרובד הסיבי מאוד אינה עומדת בעומס המכני המופעל עליה על ידי לחץ הדם ומאבדת את שלמותה המבנית7. למרות זאת, המכניקה של אירוע קרע הפלאק והקשר שלו למיקרו-מבנה הבסיסי אינם מובנים היטב8. המחקרים הניסיוניים המעטים שאפיינו אי ספיקת רקמת פלאק כללו 9,10,11,12,13 דיווחו על תכונות קרע מכני גס ( כלומר, זן וחוזק אולטימטיביים של אי ספיקת מתיחה), שנגזרו בהנחה של הומוגניות מבנית של הרקמה. עם זאת, רקמת הרובד הסיבי היא הטרוגנית מבחינה מבנית, ניתן לטעון בעיקר בשל שונות מקומית בארכיטקטורה של סיבי קולגן14. יתר על כן, הקשר בין מאפייני הכשל המכני של רקמת הרובד לבין ארכיטקטורת הקולגן נחקר רק במחקר שנערך לאחרונה על ידי Johnston et al. המחברים הראו הבדל בין פלאק בכיוון הסיבים הדומיננטי ודיווחו על לחצים אולטימטיביים גבוהים יותר וזנים אולטימטיביים נמוכים יותר עבור דגימות כובע רובד סיבי עם כיוון סיבים היקפייםבעיקר 15. עם זאת, המחקר היה מוגבל גם לתכונות מכניות ומבניות ברוטו.

כדי לשפוך אור על המידע החיוני על ארכיטקטורת הקולגן המקומית והתכונות המכניות המקומיות של רקמת הרובד הסיבי, פיתחנו במחקר הנוכחי צינור הדמיה מכנו. צינור ex vivo זה מאפשר לכמת את כיוון ופיזור סיבי הקולגן המקומיים, כמו גם זן קרע מקומי. הצנרת כוללת הדמיית MPM עם SHG כדי לדמיין סיבי קולגן ברקמת הרובד, כמו גם בדיקות DIC ומתיחה חד צירית כדי לכמת את מאפייני הקרע של הרקמה.

מיקרוסקופיית מולטיפוטונים-יצירה הרמונית שנייה (MPM-SHG) הפכה לטכניקה פופולרית לחקר קולגן ברקמות ביולוגיות16. לטכניקה יתרונות רבים בהשוואה לשיטות דימות קולגן אחרות, כגון היסטולוגיה17, דימות טנזור דיפוזיה (DTI)14 ופיזור אור בזווית קטנה (SALS)15. ראשית, הדמיה MPM-SHG אינה הרסנית, מה שהופך אותה לאידיאלית לשילוב עם בדיקות מכניות18. שנית, אות SHG הוא ספציפי עבור קולגן, ולכן אין צורך להכתים את הרקמה. בשל אורכי גל העירור הארוכים (כמעט אינפרא אדום), עומק החדירה גדול יותר מאשר בטכניקות מיקרוסקופיה אחרות16. הרזולוציה הגבוהה (רמת מיקרומטר) המושגת עם הדמיית SHG מאפשרת גם הדמיה של סיבים בודדים. זה מציע אפשרויות רבות, כגון כימות מקומי של מספר סיבי הקולגן, כיוון סיבי קולגן, ופיזור19.

מתאם תמונה דיגיטלי (DIC) בשילוב עם בדיקות מכניות הוא שיטה נפוצה להשגת תכונות מכניות מקומיות של רקמות ביולוגיות20. עם DIC, עקירה של כתמים המופעלים על פני הרקמה הוא מעקב על ידי השוואת תמונות מצלמה במהירות גבוהה שנרכשו במהלך בדיקות מכניות20. שיטת עיבוד תמונה זו משמשת להערכת זני פני השטח בשדה מלא של הדגימה20 וניתן להשתמש בה גם כדי לחקור את התנהגות הקרע של הרקמה21.

Protocol

כל השיטות המתוארות במאמר זה אושרו על ידי ועדת המחקר האתי במרכז הרפואי ארסמוס ברוטרדם; הסכמה מדעת התקבלה מחולים לפני איסוף דגימות פלאק. תרשים זרימת עבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1. 1. איסוף רקמות, הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) והכנת דגימת בדיקה איסוף ואחסון רקמותאספו דגימות טריות של רובד טרשתי אנושי ממטופלים שעברו ניתוח לכריתת עורקי התרדמה.הערה: דגימות הפלאק שנלקחו מניתוח זה כוללות את שכבת האינטימה החולה של עורק התרדמה, כולל הצטברות שומן (בריכת השומנים) והסתיידויות22. הסר את שאריות הדם באמצעות מלח חוצץ פוספט (1x PBS) וייבש את הדגימה עם פד גזה. מניחים את הדגימה בצינור של 15 מ”ל באמצעות פינצטה. הצמד להקפיא את הרקמה על ידי הנחת הצינור בחנקן נוזלי למשך 10 דקות. לאחר הקפאת הצמדה, יש לאחסן את הדגימה במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד ליום הדמיית μCT.הערה: הקפאת הצמדה ממזערת את היווצרות הגביש, מה שמוביל לנזק מיקרו-מבני ברקמה. מחקר קודם על רקמת אבי העורקים החזירי הראה כי להקפאה ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לא הייתה השפעה משמעותית על התכונות המכניות של הרקמה23. הדמיית μCTביום של הדמיית μCT, להוציא את דגימת הפלאק מתוך צינור 15 מ”ל. אם הרקמה נדבקת לצינור, מלאו את הצינורית ב-PBS בטמפרטורת החדר. השאירו את הרקמה ב-PBS עד שניתן יהיה להוציא את הדגימה מהצינור. יבש את דגימת הפלאק ביסודיות עם נייר טישו. הפעל את מערכת μCT על ידי לחיצה על הכפתור הירוק . לחצו על החימום בתוכנת ה-CT שבתחתית המסך והמתינו 15 דקות. מקם ידנית מסנן רנטגן של Cu 0.06 מ”מ + Al 0.5 מ”מ במערכת μCT. בחר את התיקיה שבה התמונות יאוחסנו. בחר את הפרמטרים בחלונית השמאלית. השתמש ברשימות הנפתחות כדי לבחור זמן סריקה של 4 דקות, רזולוציה של 172 מיקרומטר, מתח של 90 קילו וולט, אמפר של 88 mA, שדה ראייה של 86 מ”מ וסיבוב של 360°. פתח את דלת המכשיר. משוך את הפלטפורמה החוצה באופן ידני. שים פרפילם על הפלטפורמה ומקם את הדגימה על הפלטפורמה (לכיוון הקיצוניות הנוספת של הרציף). הכנס ידנית את הפלטפורמה למכשיר וסגור את הדלת. הפעל את מצב Live (סמל העין ). הזז את הפלטפורמה עם החצים במכשיר כדי למרכז את הדגימה ב- FOV. התחל הדמיה (סמל באמצע התחתון). לאחר סיום ההדמיה, לחץ על סמל הדלת בתחתית (מתחת ללחצן הביטול ). לאחר סריקת μCT, הקפיא שוב את דגימת הרובד הטרשתי כמתואר בשלב 1.1.3. אחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C עד ליום של הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטונים ובדיקות מכניות. פתח את קבצי DICOM שנרכשו של הדמיית μCT בתוכנת הקוד הפתוח 3D Slicer24. עבור אל עורך Segment . בחר צור פילוח חדש | אמצעי האחסון שיש לנתח כאמצעי אחסון ראשי. לחץ על הוסף כדי להוסיף קטע. לחץ על שמו וצבעו כדי לשנות פרמטרים אלה. כדי להגדיר את המקטעים, לחץ על אפקטים | סף בחלק התחתון של החלון. השתמש בכלי סף זה כדי להבדיל בין אזורי רקמה מסוידים (>450 HU) ולא מסוידים (<450 HU). לאחר בחירת הסף, לחץ על החל בחלק התחתון. הקש Show 3D (משמאל ל- Add) כדי להציג באופן חזותי את הפילוח בתצוגת התלת-ממד. אם ישנם אזורים של פילוח שאינם רצויים, להסיר אותם עם אפקט מספריים . שנה את אטימות המקטעים במודול הפילוח על ידי לחיצה על שם הפילוח הרצוי.הערה: במידת האפשר, ניתן לבצע הדמיית μCT וסקירה של תמונות μCT באותו יום כמו שאר הפרוטוקול. במקרה כזה, דלג על שלב 1.2.12. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי השלבים הבאים של פרוטוקול זה הם גם זמן רב ויש לבצע באותו יום. לאחר תרגול מסוים, ועם ההגדרות והרקמה המתוארות, הדמיית μCT צריכה להימשך ~ 45 דקות, סקירת תמונות μCT ~ 15 דקות, הכנת דגימת בדיקה אחת ~ 1 שעות, מיקרוסקופ ~ 4 שעות, ובדיקת מתיחה חד צירית ~ 2 שעות. בדיקת הכנה לדוגמהביום של דימות קולגן ובדיקות מכניות, יש להפשיר את הפלאק על ידי טבילה ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. פתח את הבנייה התלת-ממדית של הלוח שנוצר בשלבים 1.2.13-1.2.18 בתוכנת כלי הפריסה התלת-ממדיים. השתמש בציוני הדרך הטבעיים של רקמת הרובד כדי לזהות אילו חלקים של השחזור התלת-ממדי מתאימים לדגימת הרובד האמיתי. זהה איזה אזור בשחזור התלת-ממדי אינו מכיל הסתיידויות וזהה חזותית אזור זה ברובד האמיתי. חותכים את הרובד הפתוח לאורך ציר האורך של העורק באמצעות מספריים כירורגיים ופינצטה. אם כבר קיים חתך מהניתוח, יש להתחיל מחתך זה לשימוש מיטבי ברקמה. אם לדגימה אין צורה צינורית וקשה להגדיר את כיוון האורך, אל תכלול את הדגימה בבדיקה. גזרו דגימות בדיקה מלבניות מדגימות הפלאק. יש לוודא שדגימות הבדיקה גדולות ככל האפשר תוך הימנעות מאזורי רקמה המכילים קרעים או הסתיידויות. היזהר במהלך חיתוך זה, שכן קרע קטן או סדק בקצה דגימת הבדיקה יכול לגרום להתפשטות סדק מהסדק הקיים במהלך בדיקת מתיחה. ודא שלדגימות הבדיקה יש יחס רוחב-אורך (WL) של <1 באורך המד לאחר הרכבתו בבודק המתיחה. אם הדגימות עונות על דרישה זו, הן מתאימות לבדיקות מתיחה מתאימות מבחינת תנאי גבול25.הערה: הטווח במידות המדגם עשוי להיות גדול. הדגימות שבדקו המחברים היו באורך מד שנע בין 3.4 ל-12.9 מ”מ וברוחב שנע בין 1.6 ל-6.4 מ”מ. 2. הדמיית מיקרוסקופ מולטיפוטון ההכנותלפני יום הדמיית הקולגן והבדיקה המכנית, יש לחלק 40 גרם בסיס אלסטומר סיליקון על פני שתי שפופרות של 50 מ”ל ולהוסיף 2 גרם של חומר הריפוי לכל צינור (יחס של 1:10) באמצעות פיפט פסטר. מערבבים את שני המרכיבים עם הפיפט. צנטריפוגה את הצינורות במשך דקה אחת ב 700 × גרם כדי להסיר בועות אוויר רבות ככל האפשר. ממלאים צלחת פטרי (בקוטר 10 ס”מ) בשכבה דקה (כ-0.5-1 ס”מ) סיליקון ודגרים עליה בתנור ב-65°C למשך 3 שעות או מניחים אותה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. קחו דגימת בדיקת פלאק וקיבעו את שני קצותיו לסיליקון על-ידי הצמדת מחטים ברקמה (איור 2A). ודא שהצד המואר של הדגימה פונה כלפי מעלה. הכנס את המחטים באזור הדגימה שתהיה במלחציים של מכשיר בדיקת המתיחה במהלך הבדיקה המכנית. הרכיבו משקפי בטיחות. השתמשו בחותך צדדי כדי לקצר את המחטים כך שיבלטו החוצה פחות מכמה מילימטרים מעל פני הדגימה, כדי למנוע מהן לפגוע במטרה של המיקרוסקופ. ממלאים את צלחת הפטרי ב-PBS עד שהדגימה שקועה במים. הגדרת מיקרוסקופיהודא כי מטרה נכונה מותקנת על מיקרוסקופ multiphoton. השתמש במטרה הממוטבת להעברת אור אינפרא אדום, עם הגדלה של פי 20. הפעל את מערכת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ. כאשר תתבקש לאתחל את טבלת ההדמיה, ודא שזרוע המעבה של המיקרוסקופ נדחפת לאחור והמטרה נמצאת במיקום הנמוך ביותר. הפעל את לייזר המולטיפוטון. שימו את צלחת הפטרי עם דגימת הבדיקה בתוכה מתחת למטרה, כמו באיור 3. הקפד לא למקם את המטרה מעל הדגימה עדיין מכיוון שעדיין יש למטב את הגדרות הלייזר. אחרת, העוצמה הגבוהה האפשרית של אור הלייזר עלולה להוביל לנזק לרקמה. ודא שהמטרה שקועה מעט ב- PBS. השתמש בפיפט כדי להוסיף PBS נוסף במידת הצורך. הגדר את אורך גל האור ל- 880 ננומטר.הערה: אורך גל זה נבחר מכיוון שלמסנן פליטת SHG במערכת שני פוטונים בשימוש יש אורך גל מרכזי של כ- 440 ננומטר. עבור מיקרוסקופים אחרים, אורך גל שונה עשוי להיות ישים יותר. סריקת אריחים ובחירת מיקומי הדמיהכבה את לייזר המולטיפוטון והפעל את מצב שדה הבהירות של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעל את מצב סריקה חיה . מקם את הבמה כך שהמטרה ממוקמת מעל הדגימה והבא את משטח הדגימה למיקוד. כבה את מצב הסריקה החיה . תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שנה את מקדם הזום ל – 1 על-ידי החלקת הסרגל המיועד.הערה: גורם זום זה, יחד עם מקדם ההגדלה של המטרה (20x), קובעים את גודל התמונה שצולמה (739 מיקרומטר x 739 מיקרומטר). תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שנה את מהירות הסריקה ל- 400 הרץ, את ממוצע הקו ל- 1 ואת הרזולוציה ל- 128 x 128 פיקסלים לתמונה (גודל פיקסלים של ~ 5.8 מיקרומטר x 5.8 מיקרומטר) באמצעות הרשימות הנפתחות. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית הראשונה, לחץ על סמל דוגמת הרסטר והמתן להופעת חלונית סריקת אריחים . הפעל את מצב סריקה חיה . הזיזו את המטרה לפינה של הדגימה בעזרת הידיות בחלונית החכמה ולחצו על סמל מיקום הסימון בחלונית סריקת האריחים. חזור על פעולה זו עבור כל פינה של הדגימה. אם היא מבוצעת כהלכה, רשת עם כל האריחים שנבחרו להדמיה תופיע בצבע כתום. בטל את פונקציית התפירה האוטומטית . לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור סריקת אריחים של כל משטח הדגימה כדי לקבל סקירה כללית של הגיאומטריה של הדגימה.הערה: בהתבסס על ההגדרות, הרקמה ומערכת המיקרוסקופ המתוארות, רכישת סריקת אריחים של משטח הדגימה כולו אורכת ~10 דקות. לאחר סריקת האריחים, התבונן בקואורדינטות x ו- y של הפינה השמאלית העליונה של כל אריח בחלונית סריקת האריחים, המוצגות אוטומטית על-ידי תוכנת מערכת המיקרוסקופיה. שים לב לקואורדינטות אלה בגיליון אלקטרוני. בתוכנת המיקרוסקופ, בלוח סריקת האריחים, שימו לב למספר האריחים בכיווני x ו-y בתיבה הנקראת scanfield. שים לב לגודל סריקת האריח בגיליון האלקטרוני. חשב את הקואורדינטות של האריחים האחרים על-ידי הוספה/חיסור של גודל האריח (739 מיקרומטר).הערה: קואורדינטות אלה נחוצות כדי לזהות את המיקום המדויק של האריחים שיש לסרוק באמצעות הדמיית SHG. אם זמן ההדמיה הכולל אינו מהווה בעיה, ניתן לצלם את כל האריחים מבלי לדלג על אף אריח. מסריקת האריח, בחר את האריחים לצילום באמצעות הדמיית SHG. עבור בחירה זו, הימנע מאריחים שיהיו במלחציים והשאר אריח אחד בין כל אריח שנבחר הן בכיוון האורכי והן בכיוון ההיקפי, כפי שמוצג באיור 2B. ויזואליזציה של קולגן: הדמיית SHGכבו את האורות בחדר וכסו את שלב המיקרוסקופ בבד האפלה גם כך ששום אור מהחדר לא יגיע לגלאי.הערה: מזעור האור המגיע לגלאים יפחית את הרעש במהלך רכישת התמונה. הפעל את לייזר המולטיפוטון (MP). בחר בגלאי זיהוי שאינו נסרק (NDD) המצויד במסנן פסים של 430-450 ננומטר. זהה את מיקום האריחים לצילום באמצעות המידע שהושג בשלב 2.3.10. מלא את הקואורדינטות בתיבות המיועדות ולחץ על Enter, כך שהמטרה תזוז לאריח הימני. הפעל את מצב סריקה חיה.הערה: עם מיקרוסקופים אחרים או גרסאות חדשות יותר של תוכנת ההפעלה, ניתן לבצע מעבר למיקומים בתוך סריקת האריחים באופן אוטומטי. במקרה זה, אין צורך לציין את הקואורדינטות x ו- y של כל אריח (שלב 2.3.10) ומילוי הקואורדינטות בתוכנת ההפעלה (שלב 2.4.4). הגדל את עוצמת הלייזר של MP באמצעות המחוון בלוח העליון מתחת להגדרות נתיב הקרן כדי לקבל את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית ללא הלבנה משמעותית. לאחר מכן, התאם את רווח הגלאי לקבלת תמונות בהירות, אך ללא פיקסלים רוויים, באמצעות הידית בלוח החכם או על ידי לחיצה על שם הגלאי תחת הגדרות נתיב קרן | ערוצים נוספים. ערכים אופייניים לרווח הגלאי הם בין 500 ל- 800 וולט. השתמש בידית מיקום z בלוח החכם כדי לכוונן את מישור המיקוד. עבור לחלק העליון של הדגימה והגדר את המיקומים של החלק העליון של ערימת z על ידי לחיצה על ראש החץ בחלונית z-stack (תחת הכרטיסייה רכישה | חלוניתשלישית). לאחר מכן, התמקדו בדגימה עד שאות ה-SHG לא יזוהה עוד – זהו סוף המחסנית. שוב, לחץ על ראש החץ בחלונית z-stack כדי לקבוע מיקום זה. כשתסיים, כבה את מצב הסריקה החיה .הערה: ייתכן שהרקמה אינה שטוחה לחלוטין. לכן, משטח הדגימה של אזורים שונים ברקמה עשוי להיות בעל מיקומים שונים במקצת בכיוון z. תחת כרטיסיית הרכישה , בחלונית השנייה, שמור על מהירות הסריקה על 400 הרץ, הגדר את ממוצע הקו ל- 2 ואת הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים לתמונה (גודל פיקסלים של ~ 1.4 מיקרומטר x 1.4 מיקרומטר) באמצעות הרשימות הנפתחות. הפעל את לחצן סריקת X הדו-כיוונית. לחץ על גודל z-step בחלונית z-stack ומלא גודל z-step של 3 מיקרומטר בתיבה. לחץ על התחל בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי ליצור ערימת z. בסיום, הקפד לשמור את הקואורדינטות של האריח בשם הקובץ או לתת לכל אריח מספר משלו (כמו באיור 2B).הערה: בהתבסס על ההגדרות המתוארות, הרקמה ומערכת המיקרוסקופ, רכישת ערימת z של אריח יחיד אורכת ~10-15 דקות. שלבי ההכנה (שלבים 2.4.4-2.4.10) כלולים בהערכת זמן זו. 3. בדיקות מכניות הכנת מערך בדיקת מתיחה חד ציריתהכינו את מערך בדיקת המתיחה האופקית (איור 4) לשימוש, בהתאם להוראות של בודק המתיחה (למשל, הפעילו תוכנה, חברו מלחציים, חברו תא עומס). כדי למזער את ההחלקה של דגימת הבדיקה, חברו סרט קצף דו-צדדי (איור 4A,B-2) לפנים הפנימיות של מלחציים של בודק המתיחה ונייר זכוכית לצד הפנימי של סרט הקצף. בסופו של דבר, נייר הזכוכית יהיה במגע עם מדגם הבדיקה. הניחו את אמבט החימום (איור 4A,B-3) במקומו. מלאו את אמבט החימום ב-PBS עד לגובה הפן התחתון של המלחציים, כך שהוא עדיין לא יגיע לנייר הזכוכית. הפעל את מקור החשמל של אמבט החימום והגדר את הטמפרטורה לסביבות 37 °C (77 °F). הרכיבו את המצלמה המהירה מעל מערכת בדיקת המתיחה (איור 4A-4), למשל, באמצעות מעמד מעבדה, והרכיבו עדשה באורך מוקד של 50 מ”מ על המצלמה דרך טבעת מאריכה. ודא שהמלחציים ממוקדים וששדה הראייה גדול מספיק כדי להקליט את הדגימה במהלך כל הליך המתיחה (רוחב FOV: ± רוחב הדגימה; אורך FOV: ± פי 2 מאורך הדגימה). הרכיבו את מערכת התאורה (איור 4A-5) מעל מערכת בדיקת המתיחה, למשל, באמצעות מעמד מעבדה. הפעל את מערכת התאורה וכוונן את עוצמת האור ומיקומו כך שלא יהיו השתקפויות על משטח PBS שניתן לצפות בהן בתמונת המצלמה. התאם את זמן החשיפה והרווח של המצלמה לקבלת תמונות ברורות. הגדר את תוכנת רכישת התמונות ללכידה בקצב של 30 פריימים לשנייה ברזולוציה של 5.2 מגה פיקסל.הערה: קצב פריימים גבוה זה נחוץ כדי לבצע את ניתוח ה- DIC הבא וללמוד את התנהגות הקרע. הגדר את מהירות התזוזה של אחד המהדקים כך שקצב המאמץ ההנדסי העולמי במהלך בדיקות מכניות יהיה דומה לקצב המאמץ הפיזיולוגי in vivo של הרקמה(5%/s עבור רקמת פלאק26). יצירת דפוס כתמיםהערה: פרוטוקול דפוס כתמים זה מבוסס על עבודה קודמת של Walsh et al.27.יבש את הדגימה על ידי טבילה קלה עם נייר טישו. שים את צבע הרקמה השחור בדלי המיועד של מברשת האוויר. חברו את מברשת האוויר למדחס. הפעל את מדחס מברשת האוויר והגדר את הלחץ ל- 25 PSI. נסו ליצור תבנית כתמים אופטימלית על נייר לפני הריסוס על הרקמה. רססו מספר פעמים עד לקבלת יחס שחור/לבן של 50 :5028 . הזיזו את המחט של מברשת האוויר קדימה ואחורה כדי להתאים את החספוס של תבנית הכתם עד שגודל הכתם יהיה דומה לגודל של 3-5 פיקסלים של המצלמה המהירה29.הערה: תבנית הכתמים תשמש לשתי מטרות שונות. ראשית, התזוזה של כתמים אלה נמדדת על ידי השוואת תמונות מצלמה במהירות גבוהה שנרכשו במהלך בדיקות מכניות (DIC, שלב 4.2). שנית, דפוס כתמים זה משמש לזיהוי מיקום הקרע בתמונה של המצב הלא מעוות של הדגימה (שלב 4.3.1). יש להחזיק את מברשת האוויר במרחק של כ-30 ס”מ מדגימת הבדיקה ולרסס על משטח האור. תנו לצבע להיקשר לדגימה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לפני שתטביעו את הדגימה ב-PBS. בדיקת מתיחה חד ציריתהניחו את הדגימה במלחציים של בודק המתיחה, כאשר הכיוון ההיקפי של הדגימות מיושר עם כיוון המתיחה של המתיחה והצד המואר של הדגימה פונה כלפי מעלה. ודא שאורך המד ההתחלתי מוגדר כך שיחס WL של הפסים הוא <1. הדקו את ברגי האחיזה על ידי הפעלת מומנט של 20 cNm באמצעות מברג מומנט. עשה זאת בהדרגה על ידי הפעלת מומנט קטן על כל בורג לפני הפעלת המומנט הסופי. בדקו ויזואלית אם הדגימה מכילה קרעים שעלולים להשפיע על הבדיקות. הכנס PBS נוסף לאמבט החימום עד שהמדגם שקוע והמתן עד שהטמפרטורה של PBS תגיע שוב ל -37 מעלות צלזיוס. קבל תמונת כיול באמצעות המצלמה במהירות גבוהה, שבה דגימת הבדיקה וסרגל כלולים כהפניה. ודא שהסרגל נמצא באותו מרחק ממטרת המצלמה כמו המשטח המואר של הדגימה. צור את תא העומס והתחל להקליט את מדידות הכוח והתזוזה הגלובליות מתא העומס ומהמפעיל של בודק המתיחה. יישרו את הדגימה על ידי החלת מתיחה מוקדמת של 0.05 N כדי להיפטר מהרפיון בדגימה. בצע 10 מחזורים של התניה מוקדמת עד 10% מאמץ בהתבסס על מדידת אורך המד על ידי המפעיל לאחר יישום המתיחה מראש. התחל את בדיקת המתיחה החד צירית עד לכישלון מוחלט של הדגימה, תוך הקלטת וידאו של עיוות הדגימה באמצעות המצלמה המהירה. לאחר כשל רקמות, הפסיקו לרשום את מדידות הכוח והתזוזה הגלובליות.הערה: בודקי מתיחה מסחריים מסוימים יכולים לבצע את שלבים 3.3.6-3.3.9 באופן אוטומטי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצעדים הידניים שיש לנקוט אם אפשרות אוטומטית זו אינה כלולה בבודק המתיחה הנמצא בשימוש. הסר את דגימת הבדיקה מהתקן בדיקת המתיחה והשלך אותה בהתאם. בעת בדיקת המדגם הבא, החלף את נייר הזכוכית וסרט הקצף על המלחציים. 4. ניתוח נתונים ניתוח ארגון קולגןפתח את ערימות z המתקבלות במהלך MPM עם SHG ב- ImageJ וצור הקרנות בעוצמה מרבית (MIPs) של כל ערימת z. נתחו כל MIP בעזרת הכלי FOA (Fiber Orientation Analysis)30 מבוסס הקוד הפתוח של MATLAB כדי למדוד את זווית הכיוון של סיבי הקולגן הבודדים שנמצאים באריחים. השתמש בפרמטרים הבאים: סולמות: [3 4 5] או [2 4 6], בהתאם לקוטר כלי השיט, וסף כלי הדם: 0.999, 0.9995 או 0.9999, בהתאם לעוצמת אות SHG.הערה: פרטים נוספים על אופן השימוש בכלי זה ניתן למצוא במדריךהתוכנה 31. השתמשו בכלי קוד פתוח אחר המבוסס על MATLAB, FibLab32, כדי להתאים התפלגות גאוסית להיסטוגרמה של התפלגות הזווית.הערה: פרטים נוספים על אופן השימוש בכלי זה ניתן למצוא במדריךהתוכנה 32. מתוך תרשים ההתפלגות של גאוס המתקבל באמצעות FibLab, חלץ את הפרמטרים המבניים הבאים מסביבת העבודה של MATLAB: זווית הסיב הדומיננטית (μ p), שהיא אופן ההתפלגות, סטיית התקן (σp) של התפלגות זווית הסיב, והשבר האנאיזוטרופי (Pani = 1 − Piso).הערה: השבר האיזוטרופי הוא השטח שמתחת לקו הבסיס בהתפלגות גאוס, בעוד שהשבר האנאיזוטרופי מכיל את שטח הפסגה מעל קו בסיסזה 33. גם σp וגם Pani מספקים מידע על פיזור כיוון הסיבים באזור האריחים. לבדיקה חזותית, התווה μp באמצעות קווים מכוונים ו- σp ו- Paniבאמצעות מפות צבע. ניתוח תמונה דיגיטלית וניתוח שבריםבצע בדיקה חזותית בתמונות המצלמה כדי לזהות את הפריים שבו מתרחש התחלת הקרע. במסגרת זו, זהה חזותית את מיקום הקרע. בצע בדיקה חזותית על תמונות המצלמה כדי לזהות סדק או קרע בסופו של דבר במיקום הקרע בתחילת הבדיקה המכנית. אם קיים קרע כזה, להוציא את הדגימה מהניתוח. בצע את ניתוח ה-DIC באמצעות תוכנת הקוד הפתוח מבוססת MATLAB Ncorr (v1.2)34. בצע את השלבים במדריךNcorr 35.השתמש בתמונות המצלמה שצולמו במהלך בדיקת המתיחה עם המצלמה המהירה עבור DIC. בחר במסגרת האחרונה לפני המתיחה הסופית עד לכשל (לאחר התניה מראש) כתמונת ההתייחסות. לתמונות הנוכחיות, בחרו בכל התמונות מתחילת המתיחה הסופית ועד למסגרת האחרונה לפני המסגרת שבה התרחש התחלת הקרע. בחר את משטח הדגימה כאזור העניין (ROI). אל תכלול את האזורים הקרובים (כ-1 מ”מ) למלחציים, שכן הזנים באזורים אלה יושפעו מאוד מהאחיזה. בצע ניתוח DIC באמצעות הפרמטרים הבאים: רדיוס תת-קבוצה: 30 פיקסלים; מרווח בין תת-ערכות: שלושה פיקסלים; קיצוץ איטרציה: 50; הנורמה של חיתוך וקטור ההפרש: 10-5; רדיוס זן: 5; התפשטות אוטומטית, שלב #: 5. מניתוח DIC עם Ncorr, קבל את התפלגות Green-Lagrange (או זן אוילרי) של החזר ההשקעה. השתמש בפיזור זנים אלה כדי לחשב את זן Green-Lagrange הממוצע של כל משטח דגימת הפלאק בפריים האחרון לפני הקרע. חישוב זן לגראנז’ ירוק במיקום הקרע. מתאם נתונים מבניים ומכניים במיקום הקרעבאמצעות ציוני הדרך הטבעיים בדגימת הבדיקה והכתמים המוחלים על דגימת הבדיקה, זהה את מיקום הקרע (שזוהה בשלב 4.2.1) בתמונת הייחוס (שלב 4.2.3.1). בעזרת ציוני הדרך הטבעיים בדוגמת הבדיקה, צור שכבת-על של תמונת הייחוס וסריקת האריח (שלב 2.3) כדי לזהות את מיקום הקרע בסריקת האריח. זהה את האריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע. אם הקרע אינו באריח שנסרק באמצעות MPM-SHG, זהה את האריח הקרוב ביותר למיקום הקרע. השג את הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח שבו התרחש הקרע.

Representative Results

איסוף רקמות והכנת דגימת בדיקהאוסף הרקמה מניב דגימות רקמה סיביות פלאק שניתן לנתח לדגימות בדיקה בודדות לצורך הדמיה מבנית ובדיקת מתיחה חד צירית. באופן אידיאלי, דגימת רקמה סיבית שנאספה מכילה אזורים עם מעט או ללא קרעים (איור 5A) והסתיידויות מאקרו (איור 5B). עודף של קרעים והסתיידויות אלה (איור 5C) עלול להוביל לדגימות פלאק שאינן עומדות בדרישת ממד הדגימה שהוזכרה קודם לכן של WL 1. הדמיית מיקרוסקופ מולטיפוטוניםהדמיית SHG ועיבוד תמונה מספקים MIPs מכל אריח מצולם (איור 6A,B). עיבוד נוסף לאחר עיבוד על-ידי זיהוי סיבים (איור 6C) מניב היסטוגרמות של כיוון סיבים (איור 6D) שמהן ניתן לחלץ פרמטרים מבניים של קולגן (איור 6E). נוסף על כך, ניתן לקבל מפות צבע המציגות את פרמטרי הקולגן המבניים המקומיים על פני כל דגימת הפלאק לצורך ניתוח חזותי (איור 6F,G). עבור מדגם הבדיקה המייצג באיור 6, נמצאה שונות תוך-מדגמית גדולה בפרמטרים המבניים של הקולגן (ממוצע ± SD של μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0.49 ± 0.14, אם הכיוון ההיקפי מוגדר כ-0°). וריאציה תוך-מדגמית זו מדגישה את החשיבות של קבלת פרמטרים מבניים מקומיים במקום להניח הומוגניות. בדיקות מכניותהתנהגות קרעהמצלמה המהירה מספקת תמונות של התנהגות העיוות והקרע של דגימות הפלאק במהלך בדיקות מכניות (איור 7). מתמונות אלה ניתן לזהות את מיקום התחלת הקרע ואת נתיב התפשטות הקרע. תוצאות זיהוי הקרע אינן אופטימליות אם קיימות בועות או השתקפויות בתמונות המצלמה, או אם הקרע מתפשט מהר מדי מכדי להיקלט בקצב הפריימים שנבחר. דפוסי מאמץ מקומייםניתוח מתאם תמונה דיגיטלי על הקלטות המצלמה שנרכשו במהלך בדיקת המתיחה החד-צירית מספק את מפות העיוות המקומי של הרקמות, כגון מפות הזנים Green-Lagrange המוצגות באיור 8. מפות אלה מציגות את שלושת רכיבי הזן (εxx, εxy ו- εyy) במסגרת לפני תחילת הקרע. ממפות זנים אלה ניתן לחלץ את הזנים הממוצעים באזור עניין ואת הזנים המקומיים בנקודה, כגון מיקום הקרע. עבור המדגם המייצג באיור 8, נתוני הזנים המקומיים מראים שונות תוך-מדגיבית גדולה. עבור מדגם הבדיקה המייצג באיור 8, נמצאה שונות תוך-מדגמית גדולה בזנים המקומיים (טווחי הזנים הנצפים הם כדלקמן: εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40). זה מדגיש את החשיבות של קבלת נתונים מקומיים במקום ערכים ממוצעים ברוטו המתקבלים עם ההנחה של הומוגניות רקמות. קורלציה בין מידע על רקמות מכניות ומבניותהתוצאות הנ”ל מאפשרות לקשר בין התנהגות העיוות והקרע המקומית של הרקמה לארכיטקטורת הקולגן. לאחר זיהוי מיקום הקרע בהקלטות המצלמה (איור 9A), ניתן למפות אותו בחזרה לתמונת מצלמת הייחוס (איור 9B) ולסריקת אריחי המיקרוסקופ (איור 9C). זה מספק את אריח MPM-SHG שבו התרחש הקרע ואת הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח זה (איור 9D). הפרמטרים המבניים שנמצאו באריח שבו התרחש הקרע במדגם מייצג, המוצגים באיור 9, הם μ p = 28°, σp = 19° ו- Pani = 0.6. אותו הליך יכול להיות מיושם גם על מיקומי רקמות לא קרוע. חשוב לציין כי מיפוי מיקום הקרע בתמונת הייחוס ממסגרת הקרע עשוי להיות מאתגר במקרה של דפוס כתמים לקוי וציוני דרך טבעיים לא ברורים. בנוסף, אם ציוני הדרך הטבעיים של הרקמה אינם ברורים מספיק, רישום משותף של שכבת הסריקה של האריחים ותמונות המצלמה במהירות גבוהה עשוי להיות קשה. איור 1: תרשים זרימת עבודה של פרוטוקול הניסוי המוצג. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: בחירת אריחים להדמיית SHG מסריקת האריחים . (A) דגימת בדיקה מוצמדת לסיליקון. (B) סריקת אריחים של דגימת הבדיקה שהתקבלה במיקרוסקופ brightfield. האריחים שנבחרו להדמיית SHG מסומנים בריבועים כחולים. (C) הקרנה בעוצמה מרבית של MPM עם SHG. סרגל קנה מידה = 140 מיקרומטר (C). קיצורים: SHG = דור הרמוני שני; MPM = מיקרוסקופ מולטיפוטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: דגימת פלאק שהונחה מתחת למטרה של מיקרוסקופ רב-פוטונים. המיקום של דגימת הפלאק מאובטח על ידי צלחת פטרי ממולאת במי מלח בציפוי פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: בודק מתיחה חד-צירי מותאם אישית עם מרכיביו השונים שצוינו . (A) סקירה כוללת של המערכת. שימו לב שתוספות נייר הזכוכית במלחציים גלויות מכיוון שרק המהדקים התחתונים מחוברים. (B) תמונה מוגדלת של מהדקי המתיחה עם דגימת הבדיקה מוכנה לבדיקה. קיצורים: PVC = פוליוויניל כלוריד; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: תוצאות איסוף רקמות והכנת דגימות מדגימות מייצגות . (A) דגימת פלאק טרייה ושלמה, שנלקחה ממטופלים שעברו ניתוח לכריתת עורקי התרדמה. (B) שחזור תלת-ממדי מסריקת μCT. רקמה מסוידת מוצגת בכחול בהיר ולא מסוידת באדום. דגימה אופטימלית ללא רקמה מסוידת ניתן לקבל מהאזור שבין הקווים הכחולים. (C) שחזור תלת ממדי מסריקת μCT המראה רובד תת-אופטימלי עם עודף רקמה מסוידת. סרגל קנה מידה = 3 מ”מ. קיצור: μCT = טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: תוצאות MPM-SHG ממדגם מייצג. (A) סקירה כללית של סריקת אריחים; האריחים שנבחרו להדמיה מוצגים בכחול. (B) MIPs מאריחים שונים. (C) זיהוי סיבים על ידי הכלי FOA מאריח שנבחר (# 1). (D) היסטוגרמה של כיוון סיבים מאריח שנבחר. (E) היסטוגרמה של כיוון סיבים + התאמת גאוס, שממנה ניתן לחלץ פרמטרים מבניים של קולגן מאריח נבחר. (F) ייצוג של μ p (כיוון קו שחור) ו- σp (צבע רקע) על פני כל דוגמת הלוח. (G) ייצוג של μp (קו שחור כיוון) ו-Pani (צבע רקע) על פני כל דוגמת הלוח. פסי קנה מידה = 140 מיקרומטר (B,C). קיצורים: MPM-SHG = מיקרוסקופיה מרובת פוטונים-יצירה הרמונית שנייה; MIPs = תחזיות בעוצמה מרבית; FOA = ניתוח כיוון סיבים; μp = זווית הסיב הדומיננטית; Pani = שבר אנאיזוטרופי; σp = סטיית תקן של התפלגות זווית הסיבים; Piso = שבר איזוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: התחלת קרע והתפשטות בדגימת רקמת פלאק במהלך הליך בדיקת המתיחה.1) מצב מתוח מראש, רקמה שלמה. 2) התחלת קרע – מסגרת ראשונה בה נצפה קרע. מיקום התחלת הקרע מסומן בריבוע אדום. 3 ) ו-4) התפשטות קרע. 5) קרע מלא של דגימת הפלאק. פסי קנה מידה = 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: דפוסי זני לגראנז’ ירוקים של מדגם מייצג (εxx, εxy ו-εyy) במסגרת לפני הקרע, שהתקבלו בניתוח DIC. ניתנת סטיית תקן ממוצעת על פני כל הפלאק, יחד עם המתח במקום הקרע. קיצורים: DIC = מתאם תמונה דיגיטלית; εxx = מתח אורכי; εxy = גזירה; εyy = מתח מתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: תמונת כיסוי של מיקום הקרע (ריבוע אדום) על גבי תמונות. (A) תמונת מצלמה במהירות גבוהה, שבה מזוהה הקרע (מסגרת הקרע). (B) תמונת מצלמה במהירות גבוהה, שבה מוחלת רק מתיחה מראש (מסגרת ייחוס). (C) תמונת סריקת האריח המתקבלת באמצעות מיקרוסקופיה. (D) מפה מקודדת בצבע המציגה פרמטרים מבניים מקומיים של קולגן באריחים שונים. μp (כיוון קו שחור) ו- Pani (צבע רקע) לאורך כל דוגמת הלוח מוצגים. קיצורים: μp = זווית סיבים דומיננטית; Pani = שבר אנאיזוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

המחקר הנוכחי התמקד בפיתוח צינור דימות מכנו כדי לחקור את הקשר בין כיוון ופיזור הקולגן המקומי, תכונות מכניות מקומיות והתנהגות הקרע של רקמת רובד טרשתי סיבי. הפרוטוקול המתואר כאן הוא חדשני מכמה סיבות. ראשית, זו הפעם הראשונה שמתאם תמונה דיגיטלית מיושם כדי למדוד את העיוות המקומי של רקמת רובד סיבי תחת עומס מכני. שנית, פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתח את הקשר בין דפוס העיוות המקומי לבין ארכיטקטורת הקולגן המקומית של רקמת הרובד הסיבי. חשיבות ההערכה המקומית מודגשת הן על ידי נתוני המאמץ והן על ידי נתוני הקולגן המוצגים בסעיף התוצאות, המראים את האופי ההטרוגני של הרקמה. לכן, מומלץ להשתמש בטכניקות המאפשרות הערכה מקומית, כגון אלה המשמשות בפרוטוקול זה, למחקרים עתידיים של תכונות הרובד הסיבי.

הכנת דגימת בדיקה היא בין השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה. לוחות התרדמה הם בעיקר רקמות קולגן; עם זאת, הם עשויים להכיל הסתיידויות הנחשבות כמשפיעות על ההתנהגות המכנית הכוללת של הרובד36,37. מכיוון שהמחקר מתמקד במרכיב הרקמה הסיבית של הרובד, נמנעים הסתיידויות בדגימות הבדיקה באמצעות הדמיית μCT38. אם μCT אינו זמין, ניתן לשקול טכניקות הדמיה אחרות כגון MRI או OCT39 לאיתור האזורים המסוידים ברובד. השגת דגימות בדיקת רקמות סיביות ללא הסתיידויות ובגודל גדול מספיק שניתן לבצע לבדיקה מכנית עשויה להיות משימה מאתגרת עבור פלאקים מסוידים בכבדות או מכילים הסתיידויות מפוזרות. משימה מאתגרת נוספת בפרוטוקול היא יצירת תבנית כתמים אופטימלית למתאם תמונות דיגיטליות. DIC אופטימלי דורש יחס שחור/לבן של 50:5028 וכתמים בגודל של שלושה עד חמישה פיקסלים29 כדי להבטיח איכות מתאימה. אי עמידה בדרישות אלה עלולה לגרום למדידות מקומיות לא מדויקות של הזן. לבסוף, מיפוי מיקום הקרע לתמונות SHG יכול להיות מאתגר אם ציוני הדרך הטבעיים של הרקמה אינם ברורים. עבור דגימות כאלה, יישום של מספר סמנים fiducial על הרקמה לפני הדמיה יהיה מועיל.

טכניקת MPM-SHG המשמשת בפרוטוקול הנוכחי עדיפה על טכניקות רבות אחרות להדמיית קולגן, שכן מדובר בטכניקה ברזולוציה גבוהה ולא הרסנית עם עומק חדירה גדול יחסית. עם זאת, עומק החדירה (<400 מיקרומטר) של MPM-SHG מהווה מגבלה, שכן הוא אינו מאפשר הדמיה של כל עובי דגימות הבדיקה, שנע בין 0.5 ל -2 מ"מ. במחקר שנערך לאחרונה עם דימות תהודה מגנטית של טנזור הדיפוזיה (DT-MRI), הראינו כי כיוון הסיבים השולט בחלקים העמוקים יותר של רקמת הרובד יכול להיות שונה מזה שבחלקים השטחיים והמוארים יותר של הרקמה14. לכן, יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את ארכיטקטורת הקולגן המקומית בחלקים העמוקים יותר של דגימות רקמת רובד סיבי עבה ואת הקשר שלה למכניקת הרקמה המקומית. לשם כך ניתן להשתמש בדימות תחום תדר מרחבי מקוטב (pSFDI). טכניקת הדמיה אופטית זו שפותחה לאחרונה דווחה כבעלת פוטנציאל למדוד את כיוון הסיבים בעומק של 0.8 מ”מ בעלוני מסתם מיטרלי12. ה- pSFDI מציע גם רכישה מהירה, שיכולה גם להקל על הדמיה של אזור הדגימה כולו במקום רק מבחר אריחים, כפי שקורה בפרוטוקול הנוכחי. מגבלה נוספת של הפרוטוקול הנוכחי היא שניתן היה לזהות רק עיוות פני השטח. במחקרים עתידיים, ניתן לכלול בפרוטוקול זה DIC40 מרובה תצוגות בסיוע מראה או מתאם נפח דיגיטלי (DVC)41 כדי לקבל מידע נוסף על הזנים הנפחיים מתחת לפני השטח.

פרוטוקול הניסוי הנוכחי ניתן להרחבה נוספת או לשינוי במספר דרכים כדי לקבל מידע נוסף על מכניקת הקרע של הרובד והקשר שלו למיקרו-מבנה הבסיסי. ראשית, הפרוטוקול הנוכחי כולל בדיקות מתיחה חד צירית בכיוון ההיקפי. סוג זה של בדיקות מכניות נבחר מכיוון שהפלאק חווה בעיקר מתיחה בכיוון ההיקפי in vivo. לאפיון מכני מקיף יותר, ניתן להרחיב פרוטוקול זה עוד יותר כדי לשלב בדיקות ניפוח, בדיקות דו-צדדיות או בדיקות מתיחה חד-צירית בכיוון האורך. שנית, הפרוטוקול הנוכחי מתמקד רק בהשגת זנים מקומיים באמצעות DIC. עם זאת, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של ההתנהגות המכנית של הפלאק על ידי הכללת ניתוח מאמץ מקומי בפרוטוקול, אך הדבר דורש אפיון של נוקשות מקומית. למרות האתגר הנוכחי, ניתן להשיג זאת על ידי טכניקות חישוביות כגון שיטת היסוד הסופי ההופכי 42,43 ושיטת השדותהווירטואליים 44. מלבד התאמה ניסיונית, ניתן להוסיף כמה שלבים נוספים לאחר העיבוד לפרוטוקול הנוכחי. ראשית, במקום לזהות רק את מיקום הקרע, ניתן לזהות את נתיב התפשטות הסדק באמצעות תמונות המצלמה המהירות המתקבלות. נתיב התפשטות זה יכול להיות מתואם עם פרמטרים מבניים ומכניים מקומיים. שנית, מיקום התחלת הקרע זוהה חזותית בפרוטוקול המתואר. מחקר קודם על רקמות לא ביולוגיות השתמש בחוסר רציפות במדידות זן DIC כדי לזהות קרע45. יישום זיהוי קרע אוטומטי כזה על רקמות פלאק יכול אולי לשפר את הדיוק של זיהוי הקרע. לבסוף, יתרון גדול של MPM-SHG בהשוואה לשיטות דימות קולגן אחרות הוא שהוא מדמיין סיבי קולגן בודדים. לכן, הנתונים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש גם כדי לחקור מאפיינים מקומיים נוספים של קולגן, כגון תכולת הקולגן.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק הבנה טובה יותר של המאפיינים המקומיים של רקמת רובד סיבי, הרכיב שנכשל מכנית בקרע פלאק in vivo. מידע זה נחוץ כדי לבסס סמנים חדשים של הדמיה מבנית ותפקודית המנבאים קרע פלאק בחולים. סמנים חדשים אלה נחוצים, שכן הסמנים הביולוגיים בסיכון שהוצעו בעבר הוכחו כבעלי ערך ניבוי לא אופטימלי לאירועים קליניים עתידיים 5,6. בעתיד, OCT ו-ps-OCT יוכלו לזהות ולכמת רקמות סיביות במערכת העורקים46,47,48. בנוסף, זן נחשב סמן חלופי להרכב פלאק מקומי49. לפיכך, מדידות זן in vivo 49 עשויות לסייע בזיהוי יציבות פלאק בחולים. עם זאת, יש להיזהר עם תרגום ישיר של התוצאות המתקבלות לקרע רובד in vivo. ראשית, רקמת הרובד הסיבי חווה עומס מורכב יותר in vivo מאשר עומס מתיחה חד כיווני המשמש בפרוטוקול זה. שנית, רבדים טרשתיים הם מבנים מרובי רכיבים; התפלגות המתח והמתח in vivo ברקמת הרובד הסיבי יכולה להיות מושפעת מנוכחותם ומיקומם של מרכיבי הרובד האחרים, כגון הסתיידויות37.

ניתן להשתמש בצנרת הדמיית מכנו זו גם לחקר רקמות קולגן אחרות. בדיקות מכניות גלובליות והדמיה מבנית של קולגן כבר נמצאות בשימוש נרחב עבור רקמות ביולוגיות. עם זאת, הערכה מקומית של תכונות טרום כישלון וכשל, כמו גם ארכיטקטורת קולגן, היא קריטית לאפיון מכני מדויק של רקמות סיביות הטרוגניות. אנו צופים כי המבנה של פרוטוקול חדש זה יספק תובנה נוספת לגבי יחסי הגומלין בין המיקרו-מבנה והמכניקה של מספר רקמות ביולוגיות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק NWO-Vidi (18360).

Materials

10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. . Fibertracking Manual Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023)
  32. . FibLab Different Angle Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023)
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  36. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  37. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  38. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  39. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  40. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  41. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  43. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering – CMBE2019. , (2019).
  44. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  45. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  46. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  47. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  48. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Tags

Collagen StructureMechanical PropertiesAtherosclerotic PlaquePlaque RuptureTensile TestingMicroscopyTile Scan

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image