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Abstract
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Immunology and Infection

Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis

Published: September 26, 2022
doi:
10.3791/64329
, , ,
1Department of Clinical Immunology,Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences,Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences,Jagiellonian University Medical College

Summary

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.

Abstract

Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD), das an Mäusen untersucht werden kann. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode vorzustellen, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann. Um CHS zu induzieren, wurden Mäuse am Tag “0” an einer zuvor rasierten Stelle durch Bauchhautmalerei mit dem hapten 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch sensibilisiert, während Negativkontrollmäuse mit Vehikel-Alone-Aceton-Ethanol-Gemisch scheinsensibilisiert wurden. Am Tag “4” wurde die Grundohrendicke mit einem Mikrometer vor der Auslösung von CHS (Challenge) gemessen, indem beide Ohren mit verdünntem TNCB sowohl in der Test- als auch in der Kontrollgruppe lackiert wurden. Nach 24 h wurde die Ohrschwellung mit einem Mikrometer gemessen. CHS ist ein Beispiel für eine T-Zell-vermittelte Immunantwort, die Schwellungen in entzündetem Gewebe verursacht und 24 Stunden nach der Hautherausforderung mit der gleichen Hapten ihren Höhepunkt erreicht. Eine Zunahme des Ohrödems korrelierte mit erhöhtem Ohrgewicht, Myeloperoxidase (MPO) -Aktivität, entzündungsfördernder Zytokinkonzentration in den Ohrextrakten, erhöhter Verdickung der ödematösen Dermis in der histologischen Untersuchung und Ohrvaskulärpermeabilität. Es gab auch einen Anstieg der Konzentration von TNP-spezifischen IgG1-Antikörpern in den Seren der Testgruppe im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Darüber hinaus kann CHS erfolgreich mit den CHS-Effektorzellen übertragen werden, die von Spendern erhalten wurden, die zuvor mit TNCB sensibilisiert wurden. Die CHS-Effektorzellen wurden intravenös in naive Empfängermäuse verabreicht, die anschließend mit dem gleichen verdünnten Hapten herausgefordert wurden. Die Ohrschwellung wurde 24 Stunden später mit einem Mikrometer gemessen.

Introduction

Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige entzündliche Hauterkrankung in Industrieländern, die durch eine Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion verursacht wird, die sich aus der Exposition gegenüber niedermolekularen Chemikalien, den sogenannten Hapenten, ergibt. Zu den Substanzen, die beim Menschen eine Kontaktsensibilisierung verursachen, gehören Schwermetallionen (Chrom, Nickel, Eisen, Kobalt), Terpentin, Duftstoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe, die in Kosmetika enthalten sind (z. B. p-Phenylendiamin), einige Medikamente (z. B. Neomycin, Benzocain), β-Lactam-Antibiotika (dh Penicillin), von Pflanzen hergestellte Chemikalien (Penadecacatechol, eine Substanz, die in Giftefeu vorhanden ist) sowie Hydrochinon, das in der Fotoindustrie verwendet wird1,2 . Die ätiologischen Wirkstoffe der ACD sind sehr hoch, da allein in der Industrie über 100.000 Chemikalien verwendet werden und jedes Jahr 2.000 neue synthetisiert werden. Bis heute wurden mehr als 3.700 Moleküle identifiziert, bei denen es sich um Kontakthapten/Allergene handelnkönnte 3. Die Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion (CHS) ist ein experimentelles Modell von ACD, das an Mäusen, Meerschweinchen und Ratten untersucht werden kann und durch die topische Hautanwendung von reaktiven chemischen Hapten, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind, induziert werdenkann 4,5,6. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode zu beschreiben, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann.

Das CHS besteht aus Sensibilisierungs- (Induktions-) und Effektor- (Challenge) Phasen. In Tiermodellen binden Hapten zunächst kovalent an Proteine im Körper, um Neoantigene zu bilden. Während der Sensibilisierungsphase fördern aktivierte Keratinozyten die Migration und Reifung von dendritischen Hautzellen (sDCs), indem sie proinflammatorische Zytokine-Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Interleukin 1β (IL-1β)7 produzieren. Epidermale Langerhans-Zellen (LCs) präsentieren Antigene während der CHS-Induktions- und Effektorphase8. LCs, die während der Sensibilisierung Hapten ausgesetzt sind, fördern die Induktion von Regulations- und Effektorzellen9. Zunehmende Beweise aus mehreren Studien deuten darauf hin, dass CHS-Reaktionen entweder durch CD4 + MHC-Klasse II-eingeschränkte Th1-Zellen vermittelt werden können, die lokal Interferon-γ (IFN-γ) freisetzen, um ein charakteristisches entzündliches Infiltrat, CD8 + MHC-Klasse I-eingeschränkte Tc1-Lymphozyten zu verwenden, die auch IFN-γ freisetzen können, aber hauptsächlich zytotoxische Schäden an Keratinozyten vermitteln, und jetzt auch Interleukin 17 (IL-17) produzierendeTh17-Zellen 10, 11 .

Es wurden mehrere verschiedene CHS-Modelle mit verschiedenen Spezies 1 2,13,14 und Hatagen entwickelt (ein detaillierter Vergleich der verschiedenen Halate, Lösungsmittel und des Anwendungszeitpunkts ist in Tabelle 1 zusammengefasst). Die Maus, eine häufig verwendete Laborart, bietet einige Vorteile bei der Untersuchung von CHS. Es gibt mehr Stämme, Knockouts (KO) und transgene Tiere unter Mäusen im Vergleich zu anderen Arten, was sie zu einem sehr attraktiven Tier15 macht. Darüber hinaus erfordert das CHS-Modell viele Tiere, und Mäuse sind hier sparsamer. Tiermodelle ahmen ACD nicht in allen Aspekten nach; Insbesondere zeigen sie Krustenbildung und Desquamation, was für Menschen nicht üblich ist16,17. Die Merkmale chronischer Erkrankungen sind schwierig zu reproduzieren, vor allem, weil das beschriebene Modell die Anwendung des Hapten über einen längeren Zeitraum nicht annimmt. Es wurde hier jedoch bestätigt, dass viele der wesentlichen Aspekte von ACD reproduziert werden. Es wurde auch gezeigt, dass diese Merkmale, wie beim Menschen, mit lokalen allergischen Reaktionen verbunden sind. Die Wahl des Hapten, seines Lösungsmittels und seiner Anwendung, die in diesem Protokoll beschrieben sind, wurden durch die Tatsache bestimmt, dass die Ergebnisse durch zahlreiche In-vitro-Tests bestätigt wurden und dass es viele Jahre lang im Labor getestet und modifiziert wurde, bis die aktuelle Version etabliert wurde. Murine Modelle ermöglichen die Analyse der Zelluntergruppen oder Zytokine, die an der Entwicklung von ACD beteiligt sind und für die präklinische Bewertung neuer Behandlungen unerlässlich sind.

Protocol

Alle in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden nach den Richtlinien des 1. Lokalen Ethikkomitees für Tierversuche in Krakau durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden gemäß den lokalen Empfehlungen durchgeführt, insbesondere in Bezug auf die Verwendung von Ketamin / Xylazin als Anästhetikum, die Verwendung beider Seiten der Ohren zum Auftragen der Substanz / des Hapten, das Abschneiden des Ohrs und das Sammeln von Blut durch Augapfelentfernung. BALB/c (Haplotyp H-2d), CBA/J (H-2 k) und C5…

Representative Results

Für die CHS-Induktion wurden die Tiere durch Hautmalerei (abdominal) mit 150 μL von 5% TNCB sensibilisiert oder mit dem Vehikel allein scheinsensibilisiert. Am Tag “4” wurden die Ohrschwellungsreaktionen beider Ohren durch Kontaktmalerei (Challenge) mit 10 μL von 0,4% TNCB in beiden Mäusen induziert, die zuvor mit TNCB (Testgruppe) und den Kontrollgruppenmäusen (scheinsensibilisiert) sensibilisiert waren. Die vorgestellten Daten zeigen, dass die mit TNCB sensibilisierten und 4 Tage später herausgeforderten…

Discussion

CHS wird über Hapten induziert, die an Selbstproteinantigene in der Haut binden und Neoantigene bilden. CHS wird durch lokale extravaskuläre Rekrutierung von zirkulierenden antigenspezifischen CHS-Effektor-T-Zellen vermittelt, was zu einer Schwellung im herausgeforderten Gewebe führt, die 24 Stunden nach der Exposition der Sekundärhaut gegenüber dem gleichen Hapten6 ihren Höhepunkt erreicht. Die Schwellung des Gewebes wird hauptsächlich durch die Infiltration von Leukozyten und die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch die Subvention SUBZ unterstützt. A020.22.060 der Medizinischen Universität in Breslau, Polen, und durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung N N401 545940 an MS und IP2012 0443 72 an MMS.

Materials

70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056
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References

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Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).
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