评估半胱天冬酶活化以评估先天免疫细胞死亡

先天免疫系统在感染期间和响应无菌刺激（例如组织损伤和体内平衡改变）时充当第一道防线。细胞表面和细胞质中的先天免疫传感器对病原体或损伤相关的分子模式（分别为PAMP或DAMP）做出反应，以触发炎症信号通路和细胞反应。先天免疫反应的关键过程之一是诱导细胞死亡以去除受感染或受损的细胞，并进一步驱动先天性和适应性免疫反应。程序性细胞死亡（PCD）是跨物种的高度保守的过程，突出了其作为先天免疫机制的进化重要性。

有几种先天免疫PCD途径可以在所有细胞类型中激活。半胱天冬酶是高度保守、细胞内、半胱氨酸依赖性蛋白酶的关键家族，在许多 PCD 途径中至关重要，包括传统的非炎症性细胞凋亡途径，以及炎性 PCD 途径，如焦亡、坏死性凋亡和 PANoptosis¹，²，³，^4，5.有11种人半胱天冬酶和10种鼠半胱天冬酶是明确的，以及可能具有功能的假半胱天冬酶，并且大多数组成型表达为需要切割^{才能激活的}无活性单体或二聚体前半胱天冬酶6^，7。半胱天冬酶还包含用于募集和形成多蛋白复合物的重要结构域。这些包括半胱天冬酶活化和募集结构域（CARD），可以在半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-11中找到，或死亡效应域（DED），存在于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10中。通过其蛋白水解活性和形成多蛋白复合物的能力，半胱天冬酶是先天免疫PCD的关键驱动因素。

半胱天冬酶在先天免疫PCD中的作用首先在细胞凋亡中被鉴定，其中引发剂半胱天冬酶半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-10激活刽子手半胱天冬酶，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7，以驱动细胞死亡⁸，⁹，¹⁰，^11，12。引发半胱天冬酶可以通过不同的信号级联激活;外在途径通过细胞外配体诱导的死亡受体信号激活半胱天冬酶-8，内在途径通过破坏线粒体完整性激活半胱天冬酶-⁹¹³。活化的引发剂半胱天冬酶切割接头，分离刽子手半胱天冬酶的大小催化亚基以产生其活性形式。然后，刽子手半胱天冬酶切割其底物以分解细胞，导致DNA降解，膜起泡，核碎裂和凋亡体的释放^14，15。该过程通常以非裂解和非炎症形式的细胞死亡结束，同时通过风化细胞作用立即清除垂死细胞¹⁶。然而，胞吐作用缺陷或吞噬细胞缺乏可导致凋亡细胞积聚，然后发生溶解和炎症细胞死亡^17，18。

炎症性半胱天冬酶，包括半胱天冬酶-1（人和小鼠），半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5（人）和半胱天冬酶-11（小鼠），已被发现在一种称为焦亡的炎症先天免疫PCD（III-PCD）形式中被激活。半胱天冬酶-1 活化与炎性小体的形成有关，炎性小体是含有胞质先天免疫传感器、衔接分子（含有 CARD [ASC] 的细胞凋亡相关斑点样蛋白）和半胱天冬酶-1 的多蛋白复合物。该复合物的形成允许半胱天冬酶-1进行邻近介导的自蛋白水解以释放其活性形式，其可以切割靶底物，包括促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18以及造孔分子gasdermin D（GSDMD）¹⁹，^20，21，^22，23.半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5在感应脂多糖（LPS）等PAMP后，也可以激活GSDMD，而不会上游形成炎症小体^19，20。这些半胱天冬酶在与胞质LPS结合后经历二聚化，然后进行寡聚化和自切割以激活，这导致非规范炎症小体活化24，^25，26和半胱天冬酶-1以细胞内在方式活化以诱导IL-1β和IL-18成熟²⁰。这些促炎细胞因子的成熟和释放将这些半胱天冬酶描述为“炎症”。此外，已发现凋亡半胱天冬酶-8定位于炎性小体，在凋亡和焦亡过程之间提供了联系。研究发现，凋亡半胱天冬酶-8对于调节另一种形式的PCD也至关重要，称为坏死性凋亡。半胱天冬酶-8 的缺失导致自发受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶 3 （RIPK3） 介导的混合谱系激酶结构域样假激酶 （MLKL） 激活，以驱动坏死性凋亡的 III-PCD 途径²⁷，²⁸，²⁹，^30，31，³²，^33，34，35。

虽然半胱天冬酶历来根据它们引发的细胞死亡类型被归类为“凋亡”或“炎症性”，但越来越多的证据表明，通过半胱天冬酶的先天免疫PCD途径之间存在广泛的串扰3^，4。例如，来自炎性小体的炎性半胱天冬酶-1在其典型激活位点³⁴处切割凋亡半胱天冬酶-7。半胱天冬酶-1活化也可导致凋亡底物的切割，例如聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）³⁶。在缺乏GSDMD的细胞中，半胱天冬酶-1也可以裂解半胱天冬酶-3^37，38。此外，典型的凋亡半胱天冬酶-3可以裂解加斯皮明E（GSDME）以诱导PCD^{17，18，并将}GSDMD加工成无活性形式⁴⁰。此外，已经观察到半胱天冬酶-8募集到炎性小体复合物中39，40，41，42，⁴³，⁴⁴，^45，并且半胱天冬酶-8是典型和非典型炎症小体活化的关键调节因子³⁹。在许多炎症条件下，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-1也存在重叠和冗余的作用，并且以火光凋亡，凋亡和坏死性凋亡成分的激活为特征的先天免疫PCD发生在疾病谱^39，46，⁴⁷，⁴⁸，^49，50中。

基于炎症和凋亡半胱天冬酶之间的这种串扰，确定了先天免疫和PCD的机制理解中的一个关键差距，导致了PANoptosis的发现。PANoptosis是III-PCD的一种独特形式，其响应病原体，PAMP，DAMP和体内平衡的改变而被激活，并由PANoptosomes调节 – 多方面的大分子复合物，整合了来自其他细胞死亡途径的成分44，^50，51，52，⁵³，^54，55.PAN凋亡中生物学效应的全部不能单独通过焦亡，细胞凋亡或坏死性凋亡来单独解释3，4，³⁵，³⁶，³⁹，⁴⁶，⁴⁷，⁴⁸，因为PAN凋亡的特征是激活多种半胱天冬酶，包括半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-11，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-3和/或半胱天冬酶-7^，取决于上下文 44，48，⁴⁹，50，51，52，53，⁵⁴，^56，57，^58，59，⁶⁰，^61，62. PANoptosis越来越多地与传染病和炎症性疾病以及癌症和癌症治疗有关³，4，³⁵，³⁶，³⁹，^44，46，47，⁴⁸，⁴⁹，⁵⁰，^51，52，53，^54，56
，⁵⁷，⁵⁸，⁵⁹，^60，61，62，63，⁶⁴，^65，66.

鉴于半胱天冬酶在细胞死亡途径中的重要作用，包括在细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡和全细胞凋亡中，开发表征其激活并了解PCD途径的全部复杂性的技术非常重要。这里的协议详细介绍了一种刺激细胞并测量半胱天冬酶后续活化的方法（图1）。该方法利用半胱天冬酶的蛋白水解裂解，这通常是其激活所必需的，作为研究它们的手段。通过蛋白质印迹，可以确定蛋白质大小，从而可以清晰地观察和区分无活性的半胱天冬酶原及其活化的裂解形式。

该协议的主要优点是1）它能够评估来自单个内源性细胞群的多个半胱天冬酶的激活，以更准确地确定PCD激活和2）使用相对简单的实验室技术，不需要广泛的培训或昂贵的设备。以前的方案使用蛋白质印迹、荧光报告基因或抗体染色来监测培养上清液、细胞和组织裂解物、通过显微镜和体内⁶⁷，⁶⁸，⁶⁹，^70，71的全细胞中的半胱天冬酶活化^，但这些技术通常只监测样品中的一种或两种半胱天冬酶。此外，虽然含有半胱天冬酶切割位点的合成肽底物在切割时发出荧光，已被用于监测细胞或组织裂解物⁶⁹中的半胱天冬酶活化，但这些底物通常可以被一种以上的半胱天冬酶切割，使得难以确定该系统中单个半胱天冬酶的特异性激活。此外，使用蛋白质印迹而不是使用荧光报告基因或其他基于标签的方法允许研究人员使用内源性细胞，而不是使用报告基因创建特定的细胞系。使用内源性细胞有多种优点，包括许多永生化细胞系缺乏关键细胞死亡分子^72，73，这可能会影响结果。此外，使用内源性细胞可以评估不同的细胞类型，例如巨噬细胞，上皮细胞和内皮细胞，而不是单个谱系。蛋白质印迹也是一种相对简单且具有成本效益的技术，可以在世界各地的实验室中进行，而无需大型昂贵的设备或复杂的设置。

该协议广泛应用于生物学，以了解半胱天冬酶的细胞死亡依赖性和细胞死亡依赖性功能，包括它们的支架作用和在其他炎症信号通路中的功能⁷⁴。应用这种方法允许在研究先天免疫PCD途径和跨疾病和病症的炎症信号传导中采用统一的方法，并且该协议可用于识别关键的调节过程和机制连接，这将为未来治疗策略的发展提供信息。