JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Published: January 13, 2023
doi:
10.3791/64298
,
1Department of Embryology,Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology,Johns Hopkins University

Summary

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU’lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU’lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Abstract

Hayvanların bağırsakları, konakçı gelişimini, sağlığını ve davranışını etkileyen kommensal mikroplar tarafından kolonize edilir. Kolonizasyonun hassas bir şekilde ölçülmesi, hem mikrobiyal bileşimi doğrulamak hem de etkilerini incelemek için konakçı ve mikrop arasındaki karmaşık etkileşimleri incelemek için gereklidir. Düşük doğal mikrobiyal çeşitliliğe sahip olan ve tanımlanmış mikrobiyal bileşimi ile arkadan arkaya ekonomik olan Drosophila melanogaster, bağırsak mikrobiyomunu incelemek için model bir organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bireysel bir organizmanın mikrobiyomunu analiz etmek, hangi mikrobiyal türlerin mevcut olduğunun tanımlanmasını ve mutlak bolluklarının ölçülmesini gerektirir. Bu makale, çok sayıda bireysel sinek mikrobiyomunun analizi için bir yöntem sunmaktadır. Sinekler 96 delikli plakalar halinde hazırlanır ve aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesini sağlar. Mikrobiyal bolluk, bir dizi noktada tek bir agar plakası üzerinde 96 tam sinek homojenatının kaplanması ve daha sonra her bir noktada yetişen koloni oluşturma birimlerinin (CFU’lar) sayılmasıyla ölçülür. Bu kaplama sistemi, plakaların fotoğraflanmasını, floresan kolonilerin farklılaştırılmasını ve bir ImageJ eklentisi kullanılarak kolonilerin otomatik olarak sayılmasını içeren otomatik bir CFU niceleme platformu ile eşleştirilmiştir. Avantajları, (i) bu yöntemin tedaviler arasındaki farklılıkları tespit edecek kadar hassas olması, (ii) nokta kaplama yönteminin geleneksel kaplama yöntemleri kadar doğru olması ve (iii) otomatik sayım işleminin manuel sayımdan daha doğru ve hızlı olmasıdır. Burada sunulan iş akışı, CFU’ların çok sayıda replikasyonda yüksek verimli nicelleştirilmesini sağlar ve in vitro ve diğer küçük hayvan modelleri de dahil olmak üzere diğer mikrobiyoloji çalışma sistemlerine uygulanabilir.

Introduction

Bağırsak mikrobiyotası ve hayvan konakçısı arasındaki ilişki, mikrobiyomun suş bileşiminin konakçı fizyolojisi için önemli olduğunu gösteren biyolojik çalışmaların1 giderek daha ön saflarında yer almaktadır 2,3,4. Keşif hızı, yüksek doğal bireyler arası varyasyon ve kolonileştirici bakterilerin yüksek çeşitliliği gibi kafa karıştırıcı faktörlerle sınırlandırılmıştır 5,6,7. Meyve sineği, Drosophila melanogaster, doğal olarak düşük çeşitlilikli mikrobiyomu, kullanım kolaylığı ve sağlam konakçı genetiği 8,9,10,11 nedeniyle umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sinekler mikropsuz hale getirilebilir ve tanımlanmış bir mikrobiyota12 ile yeniden ilişkilendirilebilir ve floranın sinek fizyolojik özelliklerini etkilediği gösterilmiştir13,14. Doğuştan gelen flora, hepsi kültürlenebilen sınırlı bir bakteri kümesinden oluşur ve bunların yakın akrabaları da Lactobacilli, Proteobacteria ve Enterococci15 dahil olmak üzere memeli bağırsağına endojen olur.

Mikrobiyomun konakçı özellikleri üzerindeki etkisini incelemek, mikrobiyomun hem hangi türlerin mevcut olduğu hem de mutlak bollukları açısından ölçülmesini gerektirir16. Sinek mikrobiyomunu analiz etmenin baskın yolları, koloni oluşturan birim (CFU)sayıları 17, 16S rRNA gen amplikon dizilimi9 ve 16S rRNA geninin qPCR’si18’dir. CFU sayıları pahalı reaktifler olmadan elde edilebilir ve bakteri hücrelerinin yaşayabilirliğini doğrular19. qPCR dahil olmak üzere 16S teknikleri, mikropların taksonomik kimliklerinin, büyüme gereksinimlerine veya koloni morfolojilerine bakılmaksızın tespit edilebilmesi açısından avantajlara sahiptir20.

Deneylerin, bilinen bakterilerin (gnotobiyotik sinekler) tanımlanmış bir mikrobiyomuna sahip sinekleri kullandığı durumlarda, CFU sayımlarının dizileme21’e göre belirli avantajları vardır. Dizileme pahalıdır, DNA ekstraksiyonu, PCR tabanlı kütüphane hazırlığı ve göreceli bolluklar elde etmek için yüksek verimli dizileme gerektirir22. Yüksek maliyet nedeniyle, numune başına fiyatı23 azaltmak için yüksek verimli sıralama yöntemlerinin tipik olarak toplu olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Mutlak bolluk elde etmek için qPCR gibi diğer yöntemler gereklidir16. Buna karşılık, CFU sayımları hızlı ve ucuzdur ve mutlak sayıda canlı hücre verir. Drosophila8 ve solucan, Caenorhabditis elegans25,26 ve gnotobiyotik olarak yetiştirilen larva zebra balığı, Danio rerio dahil olmak üzere diğer küçük mikrobiyom modelleri 24, bilinen büyüme özelliklerine sahip sınırlı bir bakteri yelpazesine sahiptir28. Bu durumlarda, özellikle gnotobiyotik hayvanlarda, CFU sayımı, çok türlü bağırsak topluluklarındaki tüm bakteri türlerini ayırt edebilir21,27,29. Daha yüksek verimli CFU sayım yöntemleri, mikrobiyomun bileşimini ölçmenin maliyet etkinliğini ve hızını daha da artıracak ve diğer birçok mikrobiyoloji deneyine uygulanabilecektir.

CFU’ların agar bazlı büyüme ortamı üzerindeki bakteriyel süspansiyonun seri seyreltme kaplaması ile sayılması, mikrobiyoloji alanında standart bir yöntemdir. Plakalarda yetişen koloniler daha sonra manuel olarak sayılır. Seyreltmeler, araştırmacının sayılabilir bir koloni yoğunluğu seçmesine izin verir (örneğin, plaka başına ~ 100 CFU), yani koloniler birbirine dönüşmez ve makul bir süre içinde sayılabilir. Çoğu mikrobiyolog, 140 yıl önce Robert Koch’un laboratuvarında geliştirilen aynı CFU sayma yöntemini kullanır ve birçok uygulama için bu yöntem hala yeterlidir. Bununla birlikte, çok sayıda numuneyi ölçmeye çalışırken bir sorun ortaya çıkar. Tek bir numune, sayılabilir CFU’lar elde etmek için numunenin 1 ila 10 seri seyreltilmesinin kaplanmasını gerektirebilir, bu nedenle birkaç düzineden fazla numuneyi içeren deneyler vergilendirici hale gelir. CFU numaralandırmasının verimliliğini artırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Otomatik spiral kaplama, seri seyreltme ihtiyacını ortadan kaldırır30, CFU sayımı için yalnızca bir plaka gerekli hale getirir, ancak numunenin plakalanması süresini uzatır. Tek plakalı seri seyreltme lekelemesi (SP-SDS), numune başına daha az plakadan CFU tahminlerine olanak tanır31. Bu yöntemler, geleneksel yayılma kaplama yönteminde bir gelişmedir, ancak yine de bakteri numunelerinin tek başına işlenmesini ve kaplanmasını gerektirir ve bu nedenle yüksek verim için ideal değildir. Numunelerin 96 kuyucuklu plakalarda işlenmesi ve bu 96 numunenin dikdörtgen agar plakalar üzerinde nokta kaplaması, numunelerin verimini büyük ölçüde artırır19.

Mikrobiyomlar tipik olarak birden fazla suş ve türden oluşur. Türler genellikle koloni morfolojisi veya büyüme ortamı ile ayırt edilebilirken, floresan farklı bakteri türlerini ve büyüme özelliklerini daha da ayırt etmek için kullanılabilir32. Örneğin, aynı türün farklı genotipleri, genetik olarak kodlanmış farklı floresan proteinleri ile etiketlenebilir. Floresan içeren plaka görüntüleme yöntemleri, araştırmacıların CFU tabanlı tahlillerde bu genetik tekniklerden yararlanmalarını sağlar32. Floresanı yüksek verimli CFU sayma yöntemlerine dahil etmek, faydalarını daha da artıracaktır.

CFU’ları manuel olarak saymak, çok sayıda örnek olduğunda hantal hale gelir. CFU’ların otomatik sayımı, plakanın fotoğraflanması ve özel yazılım33 kullanılarak görüntünün işlenmesiyle gerçekleştirilebilir. Sieuwerts ve ark., geleneksel dijital fotoğrafçılık ve ImageJ yazılımı19’u kullanarak nokta kaplamanın gelişmiş kaplama verimliliğini otomatik koloni sayımı ile birleştirdi.

Belirli mikrop ve konakçı derneklerinin fenotiplerini taramak için yüksek verimli bir yöntem, mikrobiyom topluluğu derlemesi çalışmalarına ve konakçı sağlığı ve zindeliği üzerindeki etkiye yardımcı olacaktır. Drosophila mikrobiyomu çalışmaları için, yüksek verimli bir mikrobiyoloji platformu, sinek örneklerinin 96 kuyucuklu plaka formatında işlenmesini, bakteriyel lizis olmadan sinek lizisini, nokta kaplamanın verimliliğini, floresan kullanma ve çoklu floroforları ayırt etme yeteneğini, CFU plakalarının tekrarlanabilir görüntülenmesi için kontrollü bir ışık ortamını ve güvenilir bir otomatik koloni sayma yazılımını içerecektir. Bu makalede, gnotobiyotik sineklerde CFU’ların tahlili için optimize edilmiş, basit, hızlı ve otomatik olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, daha önce yayınlanmış yöntemlerin en iyisini birleştiren ve Drosophila’daki bağırsak mikrobiyomunu keşfetmek için optimize edilmiş yeni bir iş akışını özetlemektedir.

Protocol

1. Sinek kolonizasyonu NOT: Bu yöntem, CFU’ların büyüme kaplaması ile kültürlenebilir bir bağırsak mikrobiyomu ile sineklerin kantitatif analizi için uygundur. Gnotobiyotik sineklerin yetiştirilmesi için ayrıntılı bir protokol daha önce yayınlanmıştır12. Kommensal bir bakteri türü tarafından stabil kolonizasyon oluşturun.Taze bir bakteri kültürü, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g’de santrifüjleme yoluyla pelet hazırlayın ve PBS’deki hücre peletini 1.0’lık bir OD600’e geri koyun. Bu protokol için, Lactiplantibacillus plantarum (daha önce Lactobacillus plantarum olarak biliniyordu) bir gecede 2.0’lık bir OD600’e yetiştirildi. Bir sinek şişesinde yiyeceğin üzerine 100 μL pipet koyun (bkz. Eşit olarak yayın ve sıvının 15-30 dakika boyunca emmesine izin verin. Standart şişeden şişeye çevirme tekniğini kullanarak 20 mikropsuz sineği bu şişeye aktarın34. Her sinek, bakteri dozu35’in kabaca eşit miktarda yiyecektir. Alternatif olarak, mikropsuz yumurtalar eklenebilir. Sinekleri 3 gün boyunca günlük taze steril yiyeceklere aktarın. Tüm bunları bir biyogüvenlik kabininde yapın ve steril teknik kullanın (Şekil 1A-1). CFU yükünü ölçmeden önce, geçici bakterileri bağırsaktan temizlemek için sinekleri 4 saat boyunca steril agar suyu içeren bir şişeye aktarın. Agar-su şişeleri sinek için bir nem kaynağı sağlar, ancak yüzeydeki sinek veya bakteriler için besin sağlamaz. Standart gıdalarla aynı steril sinek şişelerinde hazırlanırlar, ancak sadece deiyonize su ve% 1.5 agar içerirler. 2. Sineklerin 96 delikli bir PCR plakasında ayrı ayrı homojenleştirilmesi Boncuk çırpıcı tabakları önceden hazırlayın.Boncuk ölçüm tepsisine 0,5 μm cam boncuk dökün ( Malzeme Tablosuna bakın) ( Ek Kodlama Dosyası 1 S1-boncuk-measurer.stl yardımıyla 3D yazdırılmıştır). Boncukları tepsiye tüm kuyucuklar dolu ve düz olacak şekilde yayın ve ardından fazla boncukları kurtarmak için konik bir tüpe fırçalayın. Yarı etekli bir PCR plakasını (bkz. Malzeme Tablosu) ölçüm tepsisine baş aşağı yerleştirin ve ölçüm tepsisindeki girintiye yerleştirerek kuyucuklarla hizalayın. Ardından, boncukları aktarmak için hızlıca ters çevirin. Fazla boncukları PCR plakası yüzeyinden çıkarın ve folyo ile örtün. Tüm kuyucukların boncuk içerdiğinden emin olmak için PCR plakasını kontrol edin. Tek bir kuyucuğa boncuk eklemek için gerekirse bir tartım kepçesi kullanın. Statik elektrik boncukların plaka yüzeylerine yapışmasına neden oluyorsa, ölçüm tepsisinin ve PCR plakasının arkasını etanol ile silin veya püskürtün. Alüminyum folyo ile örtün. Birçok plaka bu şekilde hazırlanabilir ve daha sonra otoklavlanabilir ve daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Kullanıma hazır olduğunda, 96 kanallı pipettörü kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL PBS ekleyin (bkz. Homojenizasyondan önce mikrop kolonize sinekleri (bkz. adım 1) etanol ile yüzey sterilize edin.Sinekleri 5 s için% 100 CO2 ile uyuşturun. Anestezi altındaki sinekleri şişeden küçük bir huni kullanarak 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1A-2). Bu çalışmada, tipik olarak tüp başına 25 sinek eklenmiştir. Hemen tüpe ~ 1 mL% 70 etanol püskürtün, tüpü kapatın ve 10 s boyunca ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, etanolün bir P1000 pipetle aspire edilmesi, sineklerin aspire edilmemesine dikkat edin. Bir kez daha etanolle, ardından steril PBS ile iki kez tekrarlayın (Şekil 1A-3). Son PBS yıkamasından sonra, tüpü kapatın ve kapak tarafı aşağıdayken, sineklerin kapağa girmesi için tezgaha birkaç kez sertçe dokunun. Tüpü açın ve forseps kullanarak sinekleri kuyucuklara dağıtın (Şekil 1A-4). Her kuyucuğa bir sinek yerleştirin (Şekil 1A-5). Sinekleri anestezi altında tutmak için yükleme sırasında plakayı buz üzerinde tutun. Termal Bond ısı sızdırmazlık folyosu kullanarak plakayı kapatın (bkz.İlk olarak, kuyucuklara yakın olan başıboş boncukları çıkarın, çünkü bunlar folyo contasında sızıntıya neden olabilir. Folyonun donuk tarafının plakaya ve parlak tarafının ısı sızdırmazlık maddesine doğru yukarı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Isı sızdırmazlık maddesini (bakınız Malzeme Tablosu) 5 sn boyunca sıkıca bastırın (Şekil 1A-6). Folyoyu sabitlemek için el aplikatörü ile yakın (bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Kötü sızdırmazlık, numune kaybının bir nedenidir. Plakayı plaka çalkalayıcıya sabitleyin. 5 dakika homojenize edin (Şekil 1A-7). Sızdırmazlık folyosundan sıvıyı çıkarmak için boncuk plakasını bir mini plaka iplikçisinde 30 sn aşağı doğru döndürün (bkz. Malzeme Tablosu). Sinek homojenatı damlacıklarının kuyucuklardan dışarı sıçramaması için plakayı tutarken folyoyu çıkarın. 3. Sinek homojenatının seri seyreltilmesi ve CFU plakalarına lekelenmesi Biyogüvenlik kabinine dört dikdörtgen MRS agar büyüme plakası yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) ve kapaklarını çıkarın. Bu protokolde L. plantarum’un büyümesi için MRS agar kullanılmıştır. Bu plakaları en az 10 dakika kurumaya bırakın (taze dökülmüşse veya depodan soğuksa 20 dakika).NOT: Plakalar ıslaksa, 96 delikli plakadan gelen damlacıklar birlikte akacak ve sayıları mahvedecektir. 96 kanallı pipetleyici kullanarak steril 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL PBS ekleyerek üç seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye P20 uçlarından oluşan bir raf yerleştirin. Bölüm 2’de hazırlanan numune plakasından 11,1 μL homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın (Şekil 1A-8). Kuyuların dibinden ziyade kuyuların ortasından çektiğinizden emin olun, çünkü sinek homojenatı ve cam boncuklar pipetleri tıkar. Boncuklar batar ve sinek parçacıkları yüzer ve orta tabakayı çoğunlukla berrak bırakır. 11.1 μL’yi, kuyucuk başına 100 μL steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcıda 600 rpm’de 10 s tutun. Beş döngü boyunca yukarı ve aşağı pipetle çekerek tekrar karıştırın. İlk seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına 11,1 μL aktarın ve sonraki iki seyreltme plakası için karıştırma adımlarını tekrarlayın. Aşağıda açıklandığı gibi seyreltme serisi kaplama yapın.Büyüme plakalarını biyogüvenlik kabininden alın. En seyreltik plakadan başlayarak, 96 delikli pipettörü kullanarak her bir kuyucuktan 2 μL’yi agar plakalarına yerleştirin (Şekil 1A-9).Pipetleyici kafasını yavaşça plakanın üzerine indirin, agarın içine bıçaklamamaya dikkat edin. Plakayı dikkatlice inceleyin ve tüm lekelerin dağıtıldığından emin olun; değilse, uygun konuma manuel olarak 2 μL ekleyin. Sıvı lekelerin hızla agarın içine batırıldığını ve birlikte çalışmadığını kontrol edin. Lekeler birlikte çalışırsa, yeni bir dizi taze agar plakasını daha uzun süre kurutun ve lekelenmeyi tekrar yapın. Birden fazla plaka tipi varsa (örneğin, farklı ortamlar veya antibiyotiklerle), bunları da tespit edin. Kalan herhangi bir çözeltiyi seyreltme plakasına geri dağıtın ve bir sonraki yüksek konsantrasyona geçin.NOT: Seyreltmeleri tespit ederken, pipet uçlarının içeriğinin önceki seyreltmeden arındırıldığından emin olmak için bir sonraki seyreltmeyi beş kez karıştırın. Seyreltme plakaları, koloni sayımları35’i etkilemeden 4 ° C’de >8 saat saklanabilir. Kalan seyreltme plakaları için adım 3.5’te açıklandığı gibi kaplama işlemini tekrarlayın, orijinal homojenatı olan plakaya kadar en seyreltikten en konsantre olana ilerleyin. Tüm sıvı agar içine emildiğinde, plakaları ters çevirin ve inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A-10). Drosophila’dan Lactiplantibacillus ve Acetobacter için MRS ortamında optimum sıcaklık 30 ° C’dir. Koloniler optimal boyuta ulaşana kadar kuluçkaya yatırın: koloniler onları açıkça görecek kadar büyüktür, ancak birbirlerinin büyümesine karışacak veya müdahale edecek kadar büyük değildir (optimal büyüklüğün nicelleştirilmesi için temsili sonuçlara bakınız).NOT: Optimal büyüme koşulları gerinime bağımlıdır ve ampirik olarak belirlenmelidir. Drosophila’dan Lactiplantibacillus için, MRS agar’da en uygun inkübasyon süresi 26 saat ila 30 saattir. Drosophila’dan Acetobacter için en uygun inkübasyon süresi, suşa bağlı olarak MRS’de 30 saat ila 48 saattir. Kuluçkadan sonra, gerekirse plakaları saymaya hazır olana kadar 4 ° C’de saklayın. 4. CFU’ların nicelleştirilmesi CFU’ları, plakaları fotoğraflayarak ve daha sonra aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik yazılım kullanarak kolonileri sayarak sayın. Plakalar 4 ° C’de depolanmışsa, önce oda sıcaklığına ulaşmalarına izin verin, böylece plakalarda parlama üreten yoğuşma olmaz. Plakaları mantıksal bir sırayla düzenleyin ve fotoğraf çekerken bu sırada tutun – dosyaları adlandırmayı kolaylaştırır. Tüm plakaları, A1 tüm plakalar için sol üst köşede olacak şekilde yönlendirin. Fotoğrafların karıştırılmamasını sağlamak için A1 köşesini benzersiz bir kimlikle etiketlemeniz önerilir. Her seyreltme serisini sırayla istifleyin. Plaka kapağını çıkarın ve plakayı A1 doğru köşeye yönlendirilmiş olarak sahneye yerleştirin. Bu tepsi plakalarının fotoğraflanması için optimize edilmiş ve floresan kolonileri görüntülemek için aydınlatma ve filtre seçenekleri içeren plaka fotoğraf kutusu (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2) için tasarımlar dahil edilmiştir. Plakaları görüntüleyin. Plakalar arasında tutarlı bir pozlama seviyesi elde etmek için fotoğraf makinesini manuel ayarlarla kullanın (bkz. Perspektif bozulmasını en aza indirmek için uzun bir odak uzaklığı ayarı önerilir. Kamera sarsıntısından kaynaklanan bulanıklığı en aza indirmek için uzaktan kumandalı bir deklanşör kullanarak fotoğrafı çekin. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deneme adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın. Bazı işletim sistemlerinde (bkz. Malzeme Tablosu), Finder’da bir dizi dosyaya sağ tıklayarak kullanışlı bir toplu yeniden adlandırma özelliği vardır. 5. Count-On-It paketini kullanarak otomatik koloni sayımı (Ek Dosya 3) ImageJ için sağlanan Croptacular eklentisini (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanarak görüntüleri kırpın. Bu eklenti, görüntüyü düzenli bir alt bölgeler dizisine bölmeye yardımcı olur (örneğin, 96 delikli bir plaka için 8 x 12). Alt bölgeler ayrı ayrı sayılacaktır.NOT: Circus adı verilen dairesel plakaları saymak için ayrı bir eklenti, Ek Kodlama Dosyası 3 Circus_.ijm’de açıklanmıştır.Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Plakaları ayırt eden dosya adlarını seçin, çünkü bu dosya adları her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Bu klasörün içinde, “kırpılmış” ve “alındılar” adlı alt klasörler oluşturun. Croptacular’ı başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam’ı tıklatın.NOT: Varsayılan ayarlar görüntülenir ve genellikle yeterlidir. Görüntünün çözünürlüğüne, aydınlatmaya, spot boyutuna vb. bağlı olarak, temel parametrelerin ayarlanması yararlı olabilir. Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay hale gelmesi gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü hala düzleştirilmiş görünmüyorsa, çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin. Ardından, sayımın yapılacağı alanın bir sınır kutusunu çizin. Tüm noktalar hücrelerinin içinde olana kadar boyutu ve oranı ayarlayın. Kılavuzu yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde, Boşluk tuşuna basın. Bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilki ile aynı açıya döndüğünden emin olun; eklenti, tüm fotoğrafların aynı hizada olduğunu varsayar. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin. Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu hatırlar; gerekirse ayarlayın ve ardından Boşluk tuşuna basın. ImageJ için sağlanan Count-On-It: Gridiron eklentisini (Ek Kodlama Dosyası 4) kullanarak plakalardaki kolonileri numaralandırın. Eklentiyi yüklemek ve kullanmak için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 3’te bulunmaktadır.Count-On-It > Gridiron’u başlatın. Croptacular ile aynı ızgara ayarlarını kullanın. Kullanıcılar bir klasörün tamamını toplu hale getirebilir, tek bir görüntüyü analiz edebilir veya geçerli görüntüden başlayabilir. Eşiği bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçerken eşiği mümkün olduğunca sıkı hale getirin. İdeal olarak, seçilen koloniler arasında bir miktar boşluk olacaktır, ancak yazılım blobları bir dereceye kadar bölümlendirebilir. Eşik tatmin edici olduğunda “İşlem Gerekli” iletişim kutusunda Tamam’ı tıklayın. Sonuçları incelemek için, yakınlaştırın ve koloni sayımlarına daha yakından bakın. İptal’e tıklamak eklentiyi iptal eder. Devam etmek için Tamam’ı tıklatın. İlk görüntüde, örneğin minimum koloni boyutunu değiştirmek için ayarlar menüsüne devam etme veya geri dönme seçeneğinin verildiğinden emin olun. Toplu işleme devam etmek için Tamam’ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuç tablosunu saklamak için bir klasör seçin. “Alındılar” klasörünü kullanın veya yeni bir klasör oluşturun. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe gelir. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam’ı tıklatın. Fotoğraflar tutarlıysa ve ayar doğruysa, “İşlem Gerekli” iletişim kutusunda Tamam’ı tıklayın.NOT: Toplu işlemdeki tüm görüntüler tamamlandıktan sonra, sonuçlar tablosu otomatik olarak makbuzlarla aynı klasöre kaydedilir. Yazılım tarafından üretilen sayım makbuzlarını gözden geçirin ve sayım hatalarını manuel olarak düzeltin. ImageJ eklentisi istatistiksel olarak doğrudur, ancak hatalar oluşur. Aykırı değerleri incelemek ve yanlış sayımları belirlemek için makbuzları kanıtlayın. Yazılım, CFU verilerini makbuzlarla aynı klasöre .csv dosyası olarak kaydeder. Kullanıcı tarafından tercih edilen yazılımı kullanarak verileri analiz edin.

Representative Results

Kolonizasyon testi kullanılarak yüzlerce bireysel sineğin CFU’larının 96 kuyucuklu plaka formatında numaralandırılmasıBirçok bireysel sinek mikrobiyomunun bileşimini anlamak için, CFU’lar, mevcut türlerin tanımlanmasını, kolonileştirilen sineklerin yüzdesini ve her bir sinekte mutlak bakteri bolluğunu sağlayan beraberindeki protokol kullanılarak ölçülmüştür. Mikrobiyom bileşiminde gözlenen büyük bireyden bireye varyasyonun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır ve kolonizasyonun istatistiksel dağılımını ölçmek bu varyasyonun incelenmesine yardımcı olabilir36,37. Önemli sayıda biyolojik replikasyon elde etmek için, CFU sayımlarını kullanarak birçok bireysel sinekte mikrop bolluğunun ölçülmesi için yüksek verimli bir boru hattı geliştirilmiştir (Şekil 1A). CFU’ların nihai nicelleştirilmesi, analizden önce sineklerin nasıl ele alındığı, örneğin yüzey sterilizasyonu, bakteri tüketiminden bu yana geçen süre ve geçici bakterilerin bağırsaktan temizlenmesi gibi faktörlerden etkilenebilir. İlk olarak, Drosophila commensal bakteri türü L. plantarum’a odaklanarak (Lp; bakınız Obadia ve ark.36’daki Lp suşu WF), sineklere ~ 105 CFU Lp dozu verildi ve şişe başına 25 sinek grubunda tutuldu. Bu sinekler ya 3 gün boyunca aynı şişede tutuldu ya da günlük olarak (Aktarılan) taze, steril yiyeceklere aktarıldı (Şekil 1B). Transfer edilmeyen sinekler daha sonra yüzey bakterilerini uzaklaştırmak için etanol içinde yıkandı (Yıkandı) veya yıkanmadı (Yıkanmadı). Yıkama, ölçülen toplam CFU’larda anlamlı olmayan bir azalma sağlamıştır (Şekil 1B), bu yüksek kontrollü aşılama koşulları altında, sinek yüzeyinin 3 gün içinde bakteriler tarafından önemli ölçüde kolonize edilmediğini göstermektedir. Diğer sinek grupları, bakterilerin gıda üzerindeki büyümeden birikmesini azaltmak için her gün transfer edildi (Aktarıldı); Ek olarak, bir grup örneklemeden önce 4 saat boyunca taze gıdaya aktarıldı (Transfer Sonrası Aktarıldı) veya geçici olarak yutulan mikropların bağırsaktan temizlenmesine izin vermek için 4 saat boyunca sadece steril agar suyu (Temizlenmiş) şişelere konur. Daha sıkı kolonizasyon ölçümü sağlamak için bu adımların her biri, etanoldeki yüzey yıkama hariç, sineklerdeki CFU’ların bolluğunda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma sağlamıştır. Steril gıdalara (Transfer Sonrası Aktarılmış) veya agar suyuna (Temizlenmiş) 4 saat boyunca yapılan transfer, ayırt edilemez etkiler üretmiştir, bu da ölçümden 4 saat önce steril koşullara transferin bakteri yükünü azalttığını gösterir. Bu sonuç, sinek bağırsağındaki bazı bağırsak bakterilerinin geçici olduğu, diğerlerinin ise daha kararlı bir şekilde ilişkili olduğu yorumu ile tutarlıdır35. Lp’nin bolluğu, temizlenmiş sineklerde 1 x 104.3 CFU / sinek ile yıkanmamış sineklerde 1 x 104.9 CFU’ya (n = 724 sinek) kadar değişmiştir. Daha sonra, aynı tahlil, sinek bağırsağını kolonize eden gram-negatif bir bakteri olan Acetobacter indonesiensis (Ai) kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1C; Obadia ve ark.36’da Ai SB003 suşuna bakınız). Lp-kolonize sineklerde olduğu gibi, yüzey sterilizasyonu CFU’larda önemli olmayan bir azalma sağlamıştır. Benzer şekilde, steril gıdalara günlük transfer, bakteri yükünü önemli ölçüde azalttı ve homojenizasyondan önce 4 saat boyunca steril koşullara transfer, bakteri yükünde daha fazla azalma sağladı. Ai’nin bolluğu, temizlenmiş sineklerde 1 x 104.7 CFU / sinek ile yıkanmamış sineklerde 1 x10 5.0 CFU’ya kadar değişiyordu (n = 528 sinek). Bu nedenle, bağırsak bakterilerinin doğru bir şekilde ölçülmesi, transfer günü de dahil olmak üzere transfer sıklığına bağlıdır. Etanol içinde yıkayarak dış bakteri yükünün giderilmesi önemli olmayan bir etkiye sahipti, ancak farklı bakteri suşları veya farklı kültür koşulları için daha önemli etkiler gözlenebilir. Bu faktörler deneysel olarak kontrol edilmelidir. Homojenizasyon yönteminin CFU sayıları üzerindeki potansiyel etkisi de test edilmiştir. Sinekler, 100 μL PBS’de 0.5 μm cam boncuklu bir boncuk çırpıcı kullanılarak homojenize edildi ve bu da bakteri hücrelerinin yaşayabilirliğini azaltabilir. İlk olarak, PBS’de Lp bakterilerinin kültürden süspansiyonu hazırlandı ve daha sonra CFU’ları pozitif bir kontrol olarak saymak için kaplandı. Aynı kültür boncuk çırpıcı plakasına yerleştirildi ve (i) boncuklarla homojenize edildi, (ii) boncuklar ve mikropsuz bir sinekle homojenize edildi veya (iii) boncuksuz PBS’de homojenize edildi (Şekil 1D). Bir sinek mevcut olduğunda boncuklardaki homojenizasyon, çözeltideki canlı hücrelerin bolluğunu önemli ölçüde etkilemedi, oysa bir sineğin yokluğunda bakterilerin homojenizasyonu önemli sayıda bakteri hücresini öldürdü. Boncuksuz PBS’de homojenizasyon da canlı hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttı. Benzer şekilde, bir sinek varlığında homojenize edildiğinde Ai canlılığı korunurken, sinek olmadan homojenizasyon, çözeltideki canlı hücrelerin sayısını azaltmıştır (Şekil 1E). Bu sonuçlar, sinek dokusunun homojenizasyon sırasında bakterileri boncuklar tarafından tahrip edilmekten koruduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, Şekil 1D ve Şekil 1E’deki deneyler, kuyu başına 10’dan fazla8 CFU ile gerçekleştirilmiştir. Uygulamada, kuyu başına ~ 106 hücreli veya daha az hücreli kuyuların, boncuklar sinek olmadan kullanıldığında çok az hücre kaybı gösterdiği bulunmuştur. Plakayı boncuk çırpma yoluyla buz üzerinde soğutmak da hücre canlılığını arttırır. Bu sonuçların önemi, okuyucuların bu potansiyel sorunların farkında olmaları ve özel kullanım durumları için uygun kontroller tasarlamaları gerektiğidir. Yüksek verimli CFU ölçümü için 96 delikli spot kaplama plakalarının doğruluğuAmaç, yüz ila binlerce bireysel sinek için CFU bolluğunu ölçmek olduğundan, geleneksel yayılmış kaplama yöntemleri engelleyici bir şekilde zaman ve malzeme yoğundur. Spot kaplama, CFU büyümesi ve numaralandırma19,31 için etkili ve verimli bir yöntemdir. Nokta kaplama yöntemi, dikdörtgen tepsi plakalarında hazırlanan ortama 2 μL bakteriyel süspansiyon dağıtmak için 96 kanallı bir pipetör kullanır (Şekil 2A). Her nokta tek bir numunenin bakteri yükünü temsil eder, bu nedenle 96 sinek tek bir plaka ile analiz edilebilir (Şekil 2B). Spot kaplamanın doğruluğu, her iki yöntem için de aynı 0.0001 OD Lp süspansiyonu kullanılarak büyüme plakaları aşılanarak geleneksel kaplama ile karşılaştırılmıştır. Süspansiyon, PBS’de beş kez seri olarak iki kat seyreltildi. Kafa kafaya bir karşılaştırma olarak, 50 μL inokülum bireysel yuvarlak plakalara yayıldı veya dikdörtgen MRS plakalarında 2 μL lekeler yapıldı. Plakalar daha sonra koloniler sayılana kadar 30 ° C’de inkübe edildi. Her seyreltme için elde edilen CFU sayımları, süspansiyonun orijinal konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılmış ve karşılaştırılmıştır (Şekil 2C). 50-500 CFU’lu yuvarlak plakalar kontrol olarak sayıldı. Yüksek verimli ve geleneksel yuvarlak kaplama yöntemleri arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Kolonilerin yoğunluğu büyümelerini ve niceliklerini etkileyebileceğinden, CFU yoğunluğunun nihai sayımlar üzerindeki etkisi test edilmiştir. Nokta başına 2 ila 25 koloni içeren noktalar, geleneksel yuvarlak plaka yöntemine kıyasla nihai sayımda hiçbir fark göstermemiştir (Şekil 2C). Ortalama 35 koloniye sahip noktalar, kontrol yayılma plakalarından biraz daha düşük çarpık sonuçlar vermiştir (Şekil 2C; p = 0,0017). Tek tek noktaların fotoğraflarının yakından incelenmesi, bu çarpıklığın yoğun noktalarda üst üste binen kolonilerden kaynaklandığını göstermiştir. Nokta başına ortalama 11 koloni bulunan noktalara dayalı ölçümler, yayılma plakalarına dayananlara en yakın konsantrasyonlarla sonuçlanmıştır (Şekil 2C; Yayılmış plakalar: ortalama = 1 x 104.4 CFU; SD = 0.086 ve 11 ortalama kolonisi olan noktalar: ortalama = 1 x 104.4 CFU; SD = 0.12, p = 0.42, Welch’in t-testi). Beyaz ışık veya floresan içeren özel bir fotoğraf platformu kullanarak niceleme için yüksek kaliteli görüntüler oluşturmaYüksek verimli nokta kaplama, doğal olarak, doğru bir şekilde sayılması gereken çok sayıda hedef alan oluşturur. Verileri belgelemek ve CFU’ların sayımını kolaylaştırmak için kaliteli fotoğraflar kullanılabilir. Ticari olarak temin edilebilen malzemeler kullanılarak sağlam ve anlaşılır bir fotoğraf platformu geliştirilmiştir (Şekil 3A). Bir dijital kamera, FluoroBox adı verilen özel yapım bir ışık kutusunun üstündeki bir brakete tutturuldu ve plakanın merkezine dik olarak doğrudan aşağıya doğru yönlendirildi. İsteğe bağlı olarak, renkli bir emisyon filtresi, bir filtre kaydırıcısı kullanılarak lensin önüne yerleştirildi. Bir ışık kalkanı, aşağıdaki LED şeritlerinden gelen doğrudan ışığı engelleyerek lensin parlamasını önledi. LED şeritler, plakadaki parlamayı önlemek için plakayı yukarıdan değil, yanlardan aydınlattı. Beyaz ışığa ek olarak, sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan proteinlerini uyarmak için tek renkli mavi ve yeşil LED’ler kullanıldı. Plaka, çekmecedeki bir plaka tutucu tarafından yerinde tutuldu ve çekmece, plakanın yerleştirilmesini kolaylaştırmak için çekmece kaydırıcıları ile donatıldı. Eksiksiz tasarımlar Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2’de mevcuttur. Lp kolonilerinin spot plakasının bir fotoğrafı, kolonilerin sayılmasına ve farklı renk ve morfolojilerin ayırt edilmesine yardımcı olmak için beyaz ışık LED’leri ve bir dijital kamera kullanılarak çekilmiştir (Şekil 3B). Aydınlatma yoğunluğunun eşit olduğunu doğrulamak için, agarın arka plan yoğunluğu bir plaka fotoğrafının farklı bölgelerinde ölçülmüştür (Şekil 3C). Kolonilerin arka plandan açıkça ayırt edilebileceğini göstermek için, plakanın farklı kısımlarındaki 10 farklı koloninin çapı boyunca yoğunluk ölçülmüş ve arka plandan yaklaşık ~% 300 daha yüksek olduğu bulunmuştur (Şekil 3C). Plaka, bir mCherry floresan proteini eksprese eden plazmidin yanı sıra plazmid içermeyen bazı Lp’ler ile Lp ile aşılandı, bu nedenle koloniler ya mCherry-pozitif ya da mCherry-negatif idi. Bu iki koloni türünü ayırt etmek için, plaka yeşil LED ışıklı (515-525 nm) ve kırmızı bir filtreli (Tiffen # 29) aynı kamera kullanılarak fotoğraflandı ve mCherry-pozitif kolonilerin floresan olmasına neden oldu (Şekil 3D). mCherry-pozitif ve mCherry-negatif arasındaki yoğunluk farkı, bir koloni örneği (n = 10 koloni) arasındaki yoğunluğu ölçerek ölçülmüştür. mCherry-pozitif koloniler, mCherry-negatif’ten ~% 1.000 daha yüksek yoğunluktaydı (Şekil 3E). GFP’yi ifade eden Ai kolonileri ve floresan ifade etmeyen Ai kolonileri, mavi LED ışıklar (465-475 nm) ve yeşil bir filtre (Tiffen # 58) kullanılarak fotoğraflandı (Şekil 3F). GFP-pozitif koloniler GFP-negatiften% 200 daha yüksek yoğunluk gösterdi (Şekil 3G). Özel ImageJ eklentisi Count-On-It kullanılarak spot plakalardaki CFU’ların otomatik sayımıFotoğraflar tek başına kolonilerin sayılmasına yardımcı olur (örneğin, verileri depolayarak, verileri paylaşarak, yakınlaştırarak, bir bindirmeyi işaretleyerek, renkleri ayırarak vb.). Bununla birlikte, yüzlerce noktanın sonuçlarını manuel olarak sayma ve düzenleme eylemi sıkıcı, zaman alıcı olabilir ve son sayımlarda insandan insana farklılıklara eğilimli olabilir. Sayım işlemini hızlandırmak ve sayımların tekrarlanabilirliğini standartlaştırmak için, Count-On-It (Şekil 4A) adlı özel bir ImageJ eklentisi geliştirilmiştir. Bu eklenti, agar plakalarındaki CFU’ların doğru yarı otomatik sayımını sağlar. Kullanıcı, ek Croptacular eklentisini kullanarak görüntüleri önce kırparak ve düzelterek saymaya hazırlar. Fotoğraflar isteğe bağlı olarak toplu olarak işlenebilir ve eşik her plaka için ayarlanabilir. Diğer bazı seçenekler, kullanıcının ışık dalga boylarını (RGB görüntüler) ayarlama, bir koloni boyutu aralığı ayarlama (piksel cinsinden), maksimum en boy oranını değiştirme ve etkin seçim ızgarasının boyutlarını özelleştirme dahil olmak üzere plaka sayımının doğruluğunu artırmasına olanak tanır. Count-On-It, her plakanın CFU sayımlarının bir sütunu olarak temsil edildiği bir sonuç tablosu çıkarır. Ayrıca, sayım sonuçlarını görsel olarak belgelemek ve manuel hata düzeltmeye yardımcı olmak için bir bindirmeyi gösteren bir fotoğraflı makbuz oluşturur (Şekil 4B). Hatalar meydana gelse de, manuel olarak sayılan kolonilerin sayısı bu eklenti kullanılarak sayılan kolonilerin sayısıyla karşılaştırıldığında (Şekil 4C), ilişki genellikle eşdeğerdi, manuel ve otomatik sayımlar arasındaki doğrusal regresyon% 90’ın üzerinde doğrulukla 0.95’lik bir eğim gösterdi (R 2 = 0.93), ancak koloni sayısı20’yi aştığında hata arttı. Count-On-It, FluoroBox’ın floresan özelliğini kullanarak floresan kolonilerini ayrı ayrı saymak için de kullanılabilir. mCherry-pozitif koloni sayımları (Şekil 4D) yazılım eklentisine karşı manuel olarak 0.92’lik bir R2’ye sahipti (Şekil 4E). Benzer şekilde, yazılım eklentisi ve manuel olarak sayılan GFP-pozitif koloniler (Şekil 4F), 0.90’lık bir R2’ye sahipti (Şekil 4G). Floresan ve floresan olmayan koloniler tek bir numunede ayırt edilebilir ve koloni büyüklüğü ve şekli ayrıca ayrı alt popülasyonları ayırt etmek için kullanılabilir (Şekil 4H-K). Fotoğraflı makbuzlar, kullanıcının sayımların doğruluğunu hızlı bir şekilde kontrol etmesini ve hataları manuel olarak düzeltmesini sağlayan bir kayıt sağlar. Şekil 4C, E, G, I, K’da, okuyucuların yöntemin ham çıktısını görebilmeleri için sayım doğruluğunu artırmak için fotoğraf makbuzları kullanılmamıştır. Şekil 4G’deki gibi, manuel olarak 1 sayımın otomatik olarak 21 sayı verdiği durumlarda, fotoğraf makbuzları kullanılarak hızlı bir şekilde tespit edilebilir. Bu durumda, plakanın kenarındaki parlama, koloni olarak sayılan kabarcıklar yarattı. Her kullanım örneği için, yazılım eklentisi için en uygun ayarların yüksek verim sayımından önce belirlenmesi gerekir. Şekil 1: Kolonizasyon testi, yüzlerce bireysel sinekteki CFU’ları 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak ölçer. (A) Protokol bölümünde açıklandığı gibi kullanılan kolonizasyon tahlili ve yüksek verimli niceleme yöntemine resimsel genel bakış. (B) Kolonizasyon testini takiben sineklerde Lactiplantibacillus plantarum (Lp) bolluğu, yüksek verimli CFU niceleme yöntemi kullanılarak değişen koşullar altında ölçülmüştür. Sinekler 3 gün boyunca aynı şişede tutuldu ve daha sonra homojenize edildi ve kaplandı (Yıkanmadı), kaplamadan önce etanol içinde yıkandı (Yıkandı), her gün hem yıkandı hem de transfer edildi (Aktarıldı), günlük olarak transfer edildi, daha sonra kaplanmadan önce steril yiyeceklerde tutuldu (Aktarıldıktan Sonra) veya 4 saat boyunca sadece su ile şişelerde tutuldu (Temizlendi) (n = 724 sinek toplamı, 3 biyolojik replikasyon ve işlem başına toplam 72 sinek). (C) (B)’deki ile aynı tahlil Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 sinek) kullanılarak yapılmıştır. (D) Lp bakteriyel süspansiyonu PBS’de hazırlandı ve daha sonra CFU’ları saymak için kaplandı veya önce boncuk çırpılarak homojenize edildi, mikropsuz (GF) bir sinek ile kombinasyon halinde boncuk çırpıldı veya boncuk çırpıcı üzerinde boncuk veya sinek olmadan çalkalandı (n = 236 örnek kuyucuk). (E) Homojenizasyon sonrası ai canlılığı, (D) ile aynı şekilde test edilmiştir (n = 282 numune kuyusu). Paneller için istatistiksel anlamlılık (B-E), Kruskal-Wallis testi ve ardından Bonferroni’nin çoklu karşılaştırma düzeltmesi ile çift Wilcoxon sıralama toplamı testleri kullanılarak hesaplandı. Kutu çeyrekler arası aralık verir. Çizgi medyanı gösterir. Bıyıklar toplam menzil verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Yüksek verimli CFU ölçümü için 96 delikli spot kaplama plakalarının doğruluğu. (A) Dikdörtgen tepsi plakalarında hazırlanan ortama 2 μL dağıtmak için 96 kanallı pipetör kullanılarak nokta kaplama. (B) 96 Lp kolonisi lekeli MRS-agar büyüme plakası. (C) Geleneksel yuvarlak plakalardan (n = 24 plaka) CFU sayımlarına dayanan Lp süspansiyonunun konsantrasyonu, seri olarak seyreltilmiş ve nokta başına ortalama koloni sayısına göre düzenlenmiş spot plakalardan (n = 680 nokta) CFU sayımlarına dayanan konsantrasyona kıyasla (üç replika plaka için her bir seyreltme faktörü için ~ 48 nokta sayılmıştır). Her veri noktası, nokta başına tam kolonileri temsil ederken, her sütun bu seyreltme için ortalama kolonileri temsil eder. Yatay noktalı çizgi, kaplanan kültürün hesaplanan CFU sayısını gösterir. Yeşil ana hatlarıyla çizilmiş noktalar geleneksel yuvarlak plaka sayımlarını vurgular. Kırmızı dolgulu noktalar, 2 μL nokta başına 11 CFU’nun optimal koloni yoğunluğunu vurgular. İstatistiksel anlamlılık, Bonferroni’nin çoklu karşılaştırma düzeltmesi ile her bir sütunun ortalamasını yayılmış plaka kontrol sütununun ortalamasıyla karşılaştıran sıradan tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplandı. Kutu çeyrekler arası aralık verir. Çizgi medyanı gösterir. Bıyıklar toplam menzil verir. **p 0,01 <. ns = önemli değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Bir fotoğraf platformu, beyaz ışık veya floresan kullanarak plakaların ölçülebilir görüntülerini üretir. (A) FluoroBox tasarımına genel bakış. (B) Beyaz ışık kullanan Lp kolonilerinin spot plakasının fotoğrafı. (C) Beyaz ışık altındaki tek kolonilerin yoğunluk profili, arka planın yoğunluğuna (BKG) kıyasla (n = 10 koloni, kesikli çizgi standart sapmayı temsil eder). (D) mCherry-pozitif Lp kolonilerini seçmek için tek renkli yeşil ışıklar ve kırmızı filtre kullanarak (B) ile aynı nokta plakasının fotoğrafı. (E) mCherry emisyonu olan ve olmayan koloniler arasındaki farkı gösteren tek kolonilerin yoğunluk profili. (F) Bazıları GFP etiketine sahip olan Ai kolonilerini içeren bir spot plakanın fotoğrafı. (G) GFP-negatif ve GFP-pozitif koloniler arasındaki farkı gösteren tek kolonilerin yoğunluk profili. E, F, G: n = her arsa için 10 koloni. Koloni çapları yaklaşık 1,5 mm’dir. Kesikli çizgi SD’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Count-On-It ImageJ eklentisi ile spot plakaların doğru sayımı. (A) Eklenti kurulum penceresinin ekran görüntüsü. (B) Eklenti, belge sayımı için bir makbuz oluşturur ve hata düzeltmeye yardımcı olur. Ankastre: Her nokta bölgesi için sayılan koloni sayısı ile bindirme; sarı taslak, tek bir koloninin sayıldığını ve birden fazla koloninin sayıldığını kırmızı gösterir. (C) Beyaz ışıklı bir görüntü kullanıldığında eklenti (otomatik) kullanılarak sayılan koloni sayısıyla karşılaştırıldığında manuel olarak sayılan kolonilerin sayısını gösteren çizim, grafikteki her bir noktanın manuel veya otomatik olarak sayılan tek bir noktayı temsil ettiği (uyum eğimi = 0,95, camgöbeği çizgisi; 1:1 çizgi kırmızı noktalıdır; R2 = 0.93, Pearson korelasyon katsayısı, p < 0.0001). (D) Fotoğraf kutusunun floresan özelliği kullanılarak mCherry-pozitif koloniler seçildiğinde eklentiden fotoğraf makbuzu görüntüsü. (E) Kırmızı floresan kullanıldığında otomatik yönteme kıyasla manuel olarak sayılan mCherry-pozitif kolonilerin sayısını gösteren çizim (uyum eğimi = 1.1, camgöbeği çizgisi; 1: 1 çizgi kırmızı noktalıdır; R2 = 0.92, Pearson korelasyon katsayısı, p < 0.0001). Aykırı değerlerin ve hataların E, G, I, K için analiz makbuzları kullanılarak düzeltilmediğini unutmayın. (F) GFP-pozitif koloniler fotoğraf kutusunun yeşil floresan özelliği kullanılarak seçildiğinde ve eklenti ile yeşil kanal seçildiğinde eklentiden alınan fotoğraflı makbuz görüntüsü. (G) Yeşil floresan aydınlatma kullanıldığında otomatik yönteme kıyasla manuel olarak sayılan GFP-pozitif kolonilerin sayısını gösteren grafik (uyum eğimi = 1.1, camgöbeği çizgisi; 1: 1 çizgi kırmızı noktalı; R2 = 0.90, korelasyonun Pearson katsayısı, p < 0.0001). (H) Eklentide yüksek floresan eşiği kullanılarak karışık koloni morfolojilerinden seçilen mCherry-pozitif koloniler. (I) Kırmızı floresan aydınlatma kullanıldığında otomatik yönteme kıyasla manuel olarak sayılan mCherry-pozitif kolonilerin sayısını gösteren grafik (uyum eğimi = 0.99; R2 = 0.91, Pearson korelasyon katsayısı, p < 0.0001). (J) mDüşük floresan eşiği kullanılarak karışık koloni morfolojilerinden seçilen kiraz-negatif koloniler. (K) Floresan olmayan kolonileri seçmek için yoğunluk eşiği ayarlandığında otomatik yönteme kıyasla manuel olarak sayılan mCherry-negatif kolonilerin sayısını gösteren grafik (uyum eğimi = 1.1; R2 = 0.85, Pearson korelasyon katsayısı, p < 0.0001). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: FluoroBox montaj talimatları. Bu dosya, okuyucuyu videoda kullanılan kontrollü aydınlatma kutusunun yapımında adım adım yürür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 2: FloroBox akrilik lazer kesim. Bu dosya, kontrollü aydınlatma kutusu için akrilik parçaları lazerle kesmek için bir kesim şablonu sağlar. Dosya bir lazer kesim akrilik satıcısına gönderilebilir. Bu protokolde kullanılan satıcı için Malzeme Tablosuna bakın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 3: Yazılım talimatları. Bu dosya, okuyucuyu, bu protokolle sağlanan Croptacular ve Count-On-It yazılımının kurulumu ve kullanımı boyunca adım adım yönlendirir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Kodlama Dosyası 1: Boncuk ölçüm tepsisi için 3D baskı kodu (S1-boncuk-measurer.stl). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Kodlama Dosyası 2: Dikdörtgen plaka fotoğraf kırpıcı ImageJ eklentisi (Croptacular_.ijm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Kodlama Dosyası 3: Yuvarlak plaka fotoğraf kırpıcı eklentisi (Circus_.ijm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Kodlama Dosyası 4: Dikdörtgen plaka 96 spot sayaç eklentisi (Gridiron_.ijm). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada sunulan ayrıntılı teknikler, bir CFU sayım deneyinde değerlendirilebilecek numune sayısında >100 kat artış sağlar. Bu teknik, bireysel sinekleri analiz etmek için 96 delikli plaka formatını kullanarak Drosophila 12,35,36’daki mikrobiyom deneyleri için mevcut yöntemleri ilerletmektedir. Ayrıca, daha verimli bir nokta kaplama yöntemi19,31 ve bir fotoğraf ve koloni sayma platformu ile otomatik bir iş akışı uygular. Bu yöntemin Drosophila için önemi, deneyleri 96 delikli plaka formatına standartlaştırmaktır, bu da CFU’ların yüksek verimli nicelleştirilmesini sağlamak için otomasyonla çok sayıda biyolojik kopyanın aynı anda kullanılmasını sağlar.

96 kuyucuklu platform, artan transfer sıklığının ve geçici bakterilerin “temizlenmesinin” hem ortalama bollukta hem de numuneler arasındaki varyasyonda önemli bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir (Şekil 1B, C), bu gelişmiş protokolün sıkılığını göstermektedir. Ortak konut sineklerinin bir sınırlaması, bakterilerin sinekler arasında yatay transferidir. Önerilen bir çözüm, sinekleri ayrı ayrı Whole Animal Feeding Flat38 gibi 96 delikli bir plaka formatında tutmaktır.

Sinekler etanol içinde yıkandığında bakteri yükünde önemli bir azalma gözlenmemiş olsa da, bu sinekler sadece 3 gün boyunca dış bakterilerin varlığında tutulmuştur. Daha uzun süre muhafaza etmek, daha büyük bir bakteri yükünün39 birikmesine izin verebilir. Bu nedenle, etanolde yıkama hala tavsiye edilir.

Sineklerin 96 delikli plakaya aktarılması, iş akışını ayarlamak için kritik ilk adımdır (Şekil 1A). Sinekler yıkandıktan sonra, kuyucuklara birer birer dağıtılırlar. Bu aşamada, her bir kuyuda hangi koşulların mevcut olduğunu not etmek ve “sinek kayboldu” gibi notları eklemek için bir plaka çizelgesi yararlıdır. Homojenizasyon, bazı önemli uyarıları olan bir başka kritik adımdır. Bakteriler, bir sinek varlığında homojenizasyon işleminde hayatta kalırlar (Şekil 1D, E) ve muhtemelen bu prensip, bakteriler sineğin bağırsağının içindeyken de geçerlidir. Bununla birlikte, bakteriler sadece boncuk çırpıcı plakalarda homojenize edildiklerinde de öldürülürler, bu da homojenizasyonun belirli durumlarda bakteri hücrelerini öldürebileceğini gösterir; bu, örneğin disseke edilmiş bağırsakları homojenize ediyorsa önemli olabilecek bir sınırlamadır. Özellikle, homojenleştirme sırasında CFU’ların kaybı, numunedeki CFU’ların sayısına bağlıdır ve kuyu başına ~ 105 CFU kullanıldığında kayıp minimumdur. CFU’ların daha fazla korunması, homojenizasyonun yarıya kadar durdurulması ve plakanın buz üzerinde soğutulmasıyla sağlanabilir.

Homojenizasyon, bilinen sayıda CFU’nun mikropsuz bir sinekle karıştırıldığı kontrol deneylerine dayanan bu protokolde 5 dakika boyunca gerçekleştirildi ve bu, sinek bakterileri için ampirik olarak çalıştı. Daha az dövülme, pipetlemeye müdahale eden daha büyük sinek parçalarının bulunmasına neden olurken, ~ 10 dakikalık önemli ölçüde daha uzun homojenizasyon süreleri CFU sayımlarını daha değişken hale getirdi. Konik plaka kuyularının daha küçük hacimli ve açılı şeklinin, silindirik 2 mL tüplere kıyasla boncuk çırpma verimliliğini azalttığı gözlenmiştir. Bu genel yaklaşımda, hangi bakteri suşlarının, hangi boncuk çırpma kabının, hangi boncukların ve hangi sinek genotipinin kullanıldığı da dahil olmak üzere birçok varyasyon mümkündür. Bireysel kullanıcı vakalarının, yaklaşımlarını oluşturmak için olumlu kontroller kullanmaları gerekir.

Nokta kaplama yöntemi belirli bir şekilde kullanıldı: PBS’deki L. plantarum WF’nin 1: 2 seyreltmesi MRS plakalarına tespit edildi ve 2 gün boyunca 30 ° C’de inkübe edildi (daha küçük koloni boyutları oluşturmak için daha kısa inkübasyon süreleri uygulanabilir). Bu yöntem, başta boncuk çırpıcı ve hem seyreltme serisi hem de spot kaplama için gerekli olan 96 kanallı pipettör (Şekil 2A) olmak üzere ekipmana önceden yatırım yapılmasını gerektirir. Bununla birlikte, oluklu pimlere sahip 96 delikli bir plaka çoğaltıcı da dahil olmak üzere daha ucuz seçenekler mevcuttur. Seyreltme serisi, CFU sayım sonuçlarının doğruluğunu etkileyen kritik bir adımdır. Arıza modları açısından, pipet uçlarını sinek parçaları veya cam boncuklarla tıkamak ve pipet uçlarının pipetleyiciye düzgün bir şekilde yapışmaması veya başka bir nedenle arızalanması mümkündür. Tüm bu sorunlar, etkilenen kuyuların eksik sayılmasına neden olur ve izlenmelidir. Seyreltme serisinin her adımında yeterli karıştırma da çok önemlidir. Her seyreltme, plakayı bir plaka çalkalayıcıya koyarak veya 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, uçları durulamaya da yarayan iyice karıştırılmalıdır. En seyreltilmiş plakadan en az seyreltilmiş plakaya kadar tespit edilerek, uçlar tüm seyreltme serisi için yeniden kullanılabilir. 1:2 seyreltmelerde, sayım, büyüklük sırasına yayılan 2-25 kolonilik bir aralıkta doğrudur (Şekil 2C). Bu nedenle, 1:10 seyreltmeler zamandan ve malzemelerden tasarruf sağlar. Yararlanılabilecek bir diğer değişken, daha küçük koloniler üretmek için ayarlanabilen ve böylece bitişik kolonilerin birleşmesini önleyerek sayılabilir noktaların aralığını artırabilen kuluçka süresidir.

Plakanın kaliteli bir fotoğrafı, CFU’ların analiz edildiği ve süresiz olarak arşivlenebildiği ham kaynak verileri haline geldiği için önemlidir. FluoroBox, agar yüzeyindeki parlamayı en aza indiren eşit ışık yoğunluğuna sahip plakaların fotoğraflarını üretmek için tasarlanmıştır. Ek olarak, tasarım tek renkli LED ışıkları ve renkli fotoğraf filtreleri kullanarak floresan kolonilerini seçici olarak fotoğraflayabilmektedir (Şekil 3A). Kontrollü aydınlatma ve kamera ayarlarına sahip FluoroBox gibi bir kurulumun oluşturulması, otomatik analiz için önemli olan CFU görüntülerinin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde artırabilir. Koloni morfolojileri, floresan yoğunluğu ve zamanın veya yoğunluğun koloni büyümesi üzerindeki etkileri, fotoğraflar kullanılarak analiz edilebilecek özelliklerden sadece birkaçıdır. Fotoğraf kutusu, floresan bakteri kullanılmıyorsa renk filtreleri ve tek renkli ışıklar olmadan oluşturulabilir, bu da maliyeti ve karmaşıklığı azaltır. Bir laboratuvar tarafından farklı bir florofor kullanılıyorsa, burada önerilenlerin yerine farklı uyarma ışıkları ve emisyon filtreleri kullanılabilir. Bir uygulama kullanılarak WiFi üzerinden bir tablete bağlanan bir kamera, hem titremeyi önlemek için otomatik deklanşör özelliği hem de veri aktarımı kolaylığı için kullanışlıdır. Görüntüler tablete ve ardından kablosuz dosya aktarım yazılımı kullanılarak bir dizüstü bilgisayara aktarılabilir. Bu özelliklere sahip önerilen kameralar Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.

Count-On-It, ImageJ ile yazılmış bir eklentidir. Otomatik CFU sayma yazılımı, plaka görüntüsünü tek tip 96 kuyucuklu bir ızgaraya böler, her ızgara hücresindeki kolonileri sayar ve sonuçları basit bir elektronik tabloda toplar. Plakadaki ve fotoğraftaki spot ızgaranın konumunda her zaman farklılıklar olduğundan, kullanıcı Croptacular eklentisini kullanarak ızgarayı fotoğrafa manuel olarak uydurmalıdır. Bu aynı zamanda parlama olan plaka kenarına yakın alanları dışlamaya yardımcı olur. Eşiği ayarlamak, görüntüden en doğru CFU sayısını elde etmenin anahtarıdır. Eşik çok yüksek ayarlanırsa, koloniler birleşir; Eşik çok düşük ayarlanırsa, koloniler hariç tutulacaktır. Eşik ayarlandıktan sonra, makro kenarları yumuşatmak ve örtüşmeyi azaltmak için gauss bulanıklığı uygular, havza filtresi çakışan kolonileri böler ve parçacıkları analiz ederek bloblar sayılır.

Bazen, kolonilerin yoğunluğu belirli bir noktada çok yüksektir. Count-On-It bununla başa çıkmanın bir yolunu sunar. Kısmen birleşmiş kolonilere sahip bir ızgara hücresindeki kolonilerin sayısını tahmin etmek için, önce dairesel bir blobun tüm plakadan ortalama alanı Cortalama olarak alınır. Ardından, blob A 1’in alanı, dairesel bir blob A1/Cort’unun ortalama alanına bölünür. Bu sayı en yakın tamsayıya yuvarlanır ve bu, bir blobda kaç koloni olduğuna ilişkin tahmindir. Bu işlev, eşiğin sayım sonuçlarını etkileyebilmesinin bir nedenidir: birleştirilmiş blob alanına karşı göreli ortalama koloni alanı, eşiğin birleştirilmiş blobları nasıl etkilediğine bağlı olarak farklı olacaktır.

Sunulan yöntemlerin çeşitli sınırlamaları vardır. Bunlar, sıvı medyayı 96 delikli plakalardan doğru bir şekilde dağıtmak için ekipman ihtiyacını içerir. 96 kanallı pipetör veya oluklu çoğaltıcı pim aracı olan bu ekipmanın elde edilmesi binlerce dolara mal olabilir. Daha ucuz alternatifler var ama daha az doğru. Count-On-It aracılığıyla otomatik sayma da bazı sınırlamalar sunar. Örneğin, karma bir popülasyondaki iki koloni türü yalnızca boyuta göre sınırlandırılmışsa, blob sayımı kolonileri doğru türe atayamaz. Bu durumda, blob içeren noktaların sayımlardan çıkarılması gerekir. Kolonilerin morfolojiye dayalı olarak daha da farklılaşması, şu anda uygulanmayan yöntemin değerli bir uzantısı olacaktır. Suşa özgü besinler ve antibiyotikler de dahil olmak üzere seçici ortamların kullanılması, karmaşık görüntü analizi ihtiyacını basitleştirir.

Meyve sineği deneylerinin 96 kuyucuklu plakalarda sürdürülmesi, tek bir deneyde test edilebilecek numune sayısını ve koşullarını çoğaltır ve Drosophila-bakteri ilişkisi fenotiplerinde yüksek verimli taramaları kolaylaştırabilir. Bu yöntemin, karmaşık karışımlardaki birçok bakteri suşunu ayırt etmek için seçici ortam kullanılarak genişletilebileceğini öngörüyoruz. Yöntem, sinek mikrobiyomunun incelenmesiyle sınırlı değildir. CFU’ların nicelleştirilmesi, içme suyundaki koliform sayımlarından patojenlerin tanımlanmasına kadar mikrobiyolojinin birçok uygulamasında yaygındır. Burada sunulan CFU kaplama sistemi, yüksek verimli ekranların yanı sıra sonuçların otomatik olarak alınması, işlenmesi, depolanması ve teslim edilmesini sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper ve Ludington laboratuvarı üyeleri bu protokolün geliştirilmesi konusunda değerli girdiler sağladı. Finansman NSF IOS hibe 2032985, NIH hibe DP5OD017851, Kanada Carnegie Enstitüsü hibesi ve Carnegie Bilim Vakfı tarafından sağlandı.

Materials

Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters Superbrightleds.com STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
Software
ImageJ64 https://imagej.net/downloads N/A Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX Apple N/A Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix BSD N/A 64 bit
Windows Microsoft N/A 64 bit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
  3. Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  5. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  6. Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
  7. D’hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
  8. Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
  9. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
  10. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
  11. Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
  12. Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
  13. Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
  14. Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
  15. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  16. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  17. Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population’s life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
  18. Ryu, J. -. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  19. Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
  20. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  21. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
  22. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  23. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
  24. Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
  28. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
  29. Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
  30. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
  31. Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
  32. Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
  33. Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
  34. Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
  35. Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
  36. Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
  37. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  38. Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  39. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).

Tags

Colony Forming UnitCFUMicrobiomeDrosophilaHigh-throughputAutomated CountingGnotobiotic96-well PlateMicrofluidicsMicrobiologyMicrobial Quantification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image