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Biology

Formazione, confinamento e osservazione della nematica attiva basata su microtubuli

Published: January 13, 2023
doi:
10.3791/64287
, , ,
1Department of Physics,University of California

Summary

Qui vengono presentati metodi per preparare la nematica attiva da microtubuli e motori di chinesina, compresa la preparazione e la costruzione di proteine e l’uso di pozzetti per il confinamento nematico attivo.

Abstract

La formazione di fasi attive basate su biopolimeri è diventata una tecnica importante per i ricercatori interessati ad esplorare il campo emergente dei cristalli liquidi attivi e i loro possibili ruoli nella biologia cellulare. Questi nuovi sistemi sono costituiti da sub-unità autoguidate che consumano energia localmente, producendo un fluido dinamico fuori equilibrio. Per formare la fase a cristalli liquidi attivi descritta in questo rapporto, vengono combinati componenti proteici purificati, inclusi biopolimeri e motori molecolari, e la fase nematica attiva si forma spontaneamente in presenza di adenosina trifosfato (ATP). Per osservare lo stato nematico, il materiale deve essere confinato in una geometria adatta per la microscopia ad una densità sufficientemente elevata. Questo articolo descrive due diversi metodi per la formazione di una fase nematica attiva utilizzando microtubuli e motori kinesin: assemblaggio di uno strato attivo bidimensionale in un’interfaccia olio e acqua e assemblaggio sotto uno strato di olio utilizzando un pozzo elastomerico. Vengono anche descritte le tecniche per inserire il materiale attivo in piccoli pozzetti di forme diverse.

Introduction

I fluidi attivi sono composti da particelle o elementi guidati dall’energia che attingono carburante dal loro ambiente locale. Nelle giuste condizioni, questi elementi attivi mobili possono agire collettivamente per produrre fluidodinamica emergente su lunghe scale di lunghezza. Ci sono una varietà di esempi di tale comportamento di fase fuori equilibrio in letteratura e le fasi attive possono essere trovate in tutto lo spettro dei sistemi viventi. Alcuni esempi notevoli sono le colonie di batteri1, i fogli cellulari2,3 e il floccaggio o sciame di organismi 4,5. Le fasi attive sono state anche ampiamente studiate in fasi condensate di filamenti citoscheletrici, sia come parte della cellula6 che in sistemi sintetici progettati per fare uso di componenti estratti biologicamente 7,8,9. L’ordinamento cristallino liquido e la formazione di difetti topologici sia in sistemi naturali che sintetici assemblati da estratti biologici sono di particolare interesse per la comunità di ricerca. Negli ultimi anni, gruppi di ricerca hanno esaminato tali sistemi, le loro proprietà fisiche fondamentali e la loro rilevanza per la biologia 2,3,10,11.

Questo articolo si concentra sulla formazione dello stato nematico attivo da una combinazione di microtubuli e proteine motorie della chinesina. Il tradizionale cristallo liquido nematico è una fase di equilibrio della materia in cui le molecole costituenti mostrano un ordinamento orientativo. Ad esempio, un fluido costituito da molecole simili a bastoncelli relativamente rigidi può esibire sia la fase nematica che, a temperature più elevate, una fase fluida isotropa non orientata12. Il primo esempio sperimentale di fase nematica attiva è stato sviluppato da Sanchez et al.13, adattando un precedente esperimento in vitro 14 in cui gruppi di proteine motorie sono stati utilizzati per produrre un movimento di taglio tra fasci di microtubuli vicini. Quando questo sistema di microtubuli fu confinato in uno strato sottile, emerse un ordine nematico spontaneo. Negli ultimi anni, lo stato nematico attivo è stato studiato intensamente da diversi gruppi di ricerca sperimentali 15,16 e teorici 17,18, concentrandosi su fenomeni come la turbolenza attiva – uno stato in cui il fluido produce flussi caotici autoguidati 19 – e difetti topologici mobili. Questo articolo descrive i metodi per preparare e formare lo stato nematico attivo da microtubuli e motori di chinesina in diverse geometrie sperimentali. In primo luogo, vengono descritti i metodi di preparazione per le diverse soluzioni componenti, seguiti dai metodi per formare il nematico attivo utilizzando due diverse geometrie della camera di flusso. Vengono mostrati i risultati tipici dell’imaging. Infine, vengono descritti i metodi per confinare il nematico attivo in pozzi e canali.

Protocol

1. Preparazione del materiale attivo NOTA: Il nematic attivo 2D viene assemblato in un processo in tre fasi. In primo luogo, vengono preparate due soluzioni separate: a) microtubuli polimerizzati e stabilizzati e b) MIX (una soluzione contenente motori kinesin). Questi sono combinati e l’attività viene avviata con l’aggiunta di adenosina trifosfato (ATP). Il materiale viene quindi confinato in una geometria adatta, in modo tale che la sua densità sia abbastanza alta da far emergere l’ordine nematico. Sono inclusi protocolli per la preparazione di tutti i componenti necessari e come assemblare la fase attiva. Preparazione del cluster di proteine motorie kinesinaEsprimere e purificare le proteine motorie ricombinanti K401-BIO (motori K401) da Escherichia coli seguendo il protocollo di Edgar C. Young20.NOTA: Le proteine motorie K401-BIO sono dimeriche e sono costituite da due teste collegate con un gambo elicoidale. I motori sono stati forniti dalla Brandeis Biomaterials Facility e utilizzati come precedentemente riportato16. Ai fini della formazione di un nematico attivo, le molecole di chinesina sono biotinilate e quindi collegate tramite un legame streptavidina per formare gruppi di chinesina fino a quattro motori 13,15,21,22. È utile esprimere la kinesina con un tag di proteina fluorescente verde (GFP). Dopo la purificazione e l’incubazione della streptavidina e dei motori sul ghiaccio per 40 minuti, congelare i motori K401 in azoto liquido in aliquote da 5 μL ad una concentrazione finale di 0,7 mg/ml e conservare a -80 °C.NOTA: l’esperimento può essere messo in pausa qui. Scongelare delicatamente la kinesina quando necessario e non ricongelare. Preparare gruppi di kinesina marcata con biotina (KSA) miscelando 24 vol% di motori K401 da 0,7 mg/ml, 27 vol% di streptavidina da 0,325 mg/ml e 3 vol% di ditiotreitolo (DTT) da 5 mM (DTT) (per prevenire l’aggregazione) a 4 °C in tampone M2B da 46 vol% (80 mM PIPES [acido 1,4-piperazinediethanesulfon, pH 6,8], 2 mM MgCl2 e 1 mM EGTA [glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N, N,N′,N′-acido tetraacetico]). Lascia che l’Arabia Saudita incubi sul ghiaccio per 40 minuti. Preparazione della soluzione di microtubuliNOTA: La guanosina-5′-[(α,β)-metileno]trifosfato, sale di sodio (GMPCPP) è un analogo idrolizzabile lentamente del guanosina trifosfato (GTP) e i microtubuli formati in presenza di GMPCPP sono tre volte più rigidi dei microtubuli GTP23 e più corti. L’uso di microtubuli corti e rigidi è favorevole alla formazione della fase nematica attiva poiché questi fattori si combinano per promuovere l’ordinamento cristallino liquido.Polimerizzare la tubulina ciclica non marcata (99%, vedi Tabella dei materiali) usando 0,6 mM GMPCPP a una concentrazione di tubulina di 6 mg / ml.NOTA: La tubulina di alta qualità può anche essere purificata dal cervello bovino o suino seguendo protocolli stabiliti o ottenuta da un’altra fonte affidabile come la Brandeis Biomaterials Facility dove i materiali possono essere spediti congelati per evitare danni. Per la purificazione della tubulina dal cervello bovino, si prega di fare riferimento al protocollo pubblicato da Bate et al.24. Per la purificazione della tubulina dal cervello suino, fare riferimento ai protocolli pubblicati da Castoldi et al.25 e Tayar et al.26. In preparazione alla polimerizzazione, preparare un bagno di calore a 37 °C e preraffreddare la centrifuga a 4 °C. Combinare la soluzione di tubulina non marcata in tampone M2B (fase 1.1.3) in una provetta ultracentrifuga da 500 μL con tubulina marcata con rodamina al 4% (vedere Tabella dei materiali) per produrre microtubuli marcati al 4% dopo la polimerizzazione. Verificare la concentrazione di tubulina utilizzando un saggio di Bradford27. La concentrazione totale di tubulina nella provetta della centrifuga deve essere di 6,5-6,9 mg/ml. Incubare la miscela di tubuline su ghiaccio per 10 minuti e ultracentrifugare per 10 minuti a 352.700 x g a 4 °C. Questo passaggio rimuove la tubulina disfunzionale, che sarà nel pellet. Utilizzando una pipetta, estrarre con cura il surnatante contenente tubulina funzionale in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere GMPCPP a una concentrazione finale di 0,6 mM per indurre la polimerizzazione della tubulina e DTT a una concentrazione finale di 1 mM per prevenire l’aggregazione proteica. Incubare la miscela nel bagno di calore a 37 °C per 30 minuti, quindi centrifugare nuovamente per 10 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante, quindi diluire il pellet con tampone M2B per raggiungere una concentrazione finale di microtubuli di 6 mg / ml.NOTA: Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per almeno 4 ore prima dell’uso. Per verificare che i microtubuli si siano polimerizzati correttamente, diluire 1 μL della soluzione di microtubuli 100:1 con tampone M2B e pipetta su un vetrino da microscopio. Coprire con un vetrino di copertura per l’imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con un obiettivo 40x.NOTA: Le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione sono scelte in base all’etichettatura a fluorescenza utilizzata sui microtubuli. In questo protocollo, viene utilizzata l’etichettatura della rodamina (vedere il passaggio 1.2.2), quindi l’imaging viene eseguito utilizzando una banda di eccitazione di 515-560 nm e un filtro passa-lungo 590 nm. La Figura 1 mostra un esempio rappresentativo. Al termine della polimerizzazione, congelare i microtubuli come aliquote da 2 μL in azoto liquido e conservarli a -80 °C (se necessario). Preparazione del MIXNOTA: MIX è una soluzione acquosa che include i cluster kinesina-streptavidina (KSA). Il MIX preparato deve essere conservato a -80 °C in 4 μL di aliquote prima dell’esperimento. Quando MIX è combinato con ATP e la soluzione di microtubuli descritta al punto 1.2 a temperatura ambiente, viene avviata l’attività. MIX è preparato come segue13,19.Preparare una soluzione per prevenire lo sbiadimento della fluorescenza (ANTIFADE) mescolando due soluzioni antiossidanti. Combinare AO1 (250 mM DTT, 65 mM catalasi) e AO2 (750 μM catalasi, 3 mM glucosio ossidasi) in un rapporto di volume 1:1. Includere 20 mM Trolox, un altro antiossidante utilizzato per ridurre i danni causati dalla microscopia a fluorescenza. Preparare il MIX producendo una soluzione di KSA (descritta nella fase 1.1.3) che includa 6 wt% in 20 kDa di polietilenglicole (PEG) per indurre il raggruppamento dei microtubuli, 3 vol% di ANTIFADE e 5 vol% di piruvato chinasi/lattica deidrogenasi (PKLDH) a 70 mg/ml per la rigenerazione dell’ATP. 2. Creare il nematico attivo NOTA: l’attività nel materiale è iniziata dall’aggiunta di ATP. La rete attiva viene preparata fresca per ogni esperimento aggiungendo ATP ad una concentrazione abbastanza alta da indurre l’attività motoria. Per formare una fase nematica attiva uniforme e completamente sviluppata, i microtubuli devono avere una densità sufficientemente elevata. Ciò può essere ottenuto confinando i microtubuli tra due fluidi immiscibili per formare uno strato nematico attivo bidimensionale (2D). Questo metodo è stato originariamente sviluppato presso la Brandeis University13 e rimane una tecnica popolare per produrre una fase nematica attiva omogenea, di alta qualità. Metodo delle celle a flusso per la formazione di nematici attiviPreparare i coprivetrini idrofili con un rivestimento in acrilammide.Pulire accuratamente i coperchi con acqua saponata, etanolo e 0,1 M NaOH con risciacqui alternati con acqua nanopura. Una volta risciacquati, rivestire i vetrini con una soluzione silana composta da 100 ml di etanolo, 1 ml di acido acetico e 500 μL di 3-(trimetossisilil) propilmetacrilato per 15 minuti, quindi risciacquare con acqua nanopura. Preparare una soluzione di acrilammide da 95 ml di acqua nanopura e 5 ml di acrilammide al 40% in peso, quindi degasare la soluzione per 30 minuti in un forno sottovuoto. Aggiungere 35 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) per una concentrazione finale di 2,3 mM e quindi 0,07 g di persolfato di ammonio. Versare la soluzione di acrilammide sui coprivetrini a faccia in su e incubare durante la notte a temperatura ambiente. Preparare vetrini da microscopio idrofobico. Pipettare 100 μL di una soluzione idrorepellente (vedere Tabella dei materiali) su un vetrino da microscopio in vetro pulito, quindi posizionare un altro vetrino pulito sulla parte superiore. Ciò garantisce un rivestimento uniforme della soluzione idrorepellente sulla superficie in cui si trova per 2 minuti. Dopo 2 minuti, rimuovere il secondo vetrino e sciacquare accuratamente il primo vetrino con acqua nano-pura, quindi asciugare con gas azoto. Pulire delicatamente la regione in cui verrà posizionato il nastro (attorno al modello) con acetone per garantire che la soluzione idrorepellente non impedisca l’adesione al vetro. Preparare una miscela di olio ingegnerizzato che includa 1,8% (v/v) 008-FluoroTensioattivo (vedi Tabella dei materiali). Assemblare il vetrino e il coprivetrino con il vetrino idrofobo sul fondo della cella di flusso e il vetrino idrofilo come superficie superiore in una geometria a sandwich utilizzando distanziali biadesivi da 40 μm. Posizionare i distanziatori a 1,5 mm di distanza sul vetrino del microscopio idrofobo. Quindi posizionare il coprislip rivestito di acrilammide sopra i distanziatori con il lato trattato rivolto verso il basso per aderire. Assicurarsi che l’adesione sia completa con la pressione di un oggetto contundente.NOTA: L’obiettivo è quello di assemblare una cella di flusso con un’interfaccia olio / acqua piatta all’interno (Figura 2A, B). È qui che si formerà il livello attivo. Nastri e pellicole distanziatori alternativi possono anche essere utilizzati per produrre uno spessore di cella simile. Dopo aver costruito la cella di flusso, pipettare immediatamente la miscela di olio nella cella di flusso, riempiendo lo spazio chiuso. Utilizzando una pipetta, in un flaconcino separato mescolare delicatamente 6 μL di materiale attivo con 3,73 μL di MIX, 1 μL di soluzione di microtubuli, 0,6 μL di soluzione di ATP (la concentrazione può essere variata per variare la velocità dei microtubuli) e 0,67 μL di tampone M2B. Pipettare il materiale attivo appena miscelato in un’estremità aperta della cella di flusso, i volumi variano ma devono superare il volume della cella di flusso (circa 3-6 μL). Parte dell’olio sarà spostato dalla soluzione acquosa mentre viene iniettato nel canale; Questo può essere assorbito all’estremità opposta del canale di flusso usando un piccolo pezzo di carta velina. Dopo il riempimento, sigillare entrambi i lati della cella di flusso con una colla epossidica (vedi Tabella dei materiali) che si indurisce se esposta alla luce UV per 20 secondi.NOTA: A questo punto, il materiale attivo forma una rete 3D che rimane sospesa nello strato d’acqua. Per confinare lo strato attivo tra i due fluidi immiscibili in uno strato quasi-2D, posizionare la cella di flusso in una centrifuga a secchio oscillante (vedi Tabella dei materiali) con la fase acquosa sopra e lo strato di olio più denso sotto. Centrifugare a 212 x g per 10 min. Al termine di questa fase, la cella a flusso può essere portata a un microscopio a epifluorescenza per l’imaging con un obiettivo di ingrandimento 10x o 20x. La Figura 2C,D mostra le immagini tipiche prima e dopo questo passaggio. Metodo invertito per la formazione di nematici attiviNOTA: Un metodo alternativo a quello descritto al punto 2.1 consiste nell’assemblare lo strato nematico attivo sotto uno spesso strato di olio confinato in un pozzo PDMS profondo28. Questo metodo produce risultati simili ed è un po ‘più facile da padroneggiare; Tuttavia, la qualità dell’immagine che utilizza questo metodo di solito non è buona come il metodo della cella di flusso.Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando un agente polimerizzante elastomerico e una base di elastomero (vedere Tabella dei materiali). Mescolare i due componenti in un rapporto 1:10 usando una spatola metallica. Durante la miscelazione compaiono piccole bolle difficili da rimuovere e la miscela appare lattiginosa. Per rimuovere queste bolle, posizionare la miscela sotto vuoto a degassare per 1 ora, dopo di che il PDMS non polimerizzato dovrebbe apparire trasparente.NOTA: Il PDMS è ora pronto per formare qualsiasi forma utilizzando uno stampo, oppure può polimerizzare nel contenitore e quindi essere tagliato o punzonato nel modello desiderato. Versare il PDMS in uno stampo adatto e lasciare polimerizzare per una notte a 60 °C.NOTA: Non trattata, la superficie del PDMS polimerizzato è idrofoba, ma con il trattamento superficiale, può essere resa idrofila. Per preparare una superficie PDMS idrofila, rivestire il PDMS con un pennello polimerico acrilammide29. Questo passaggio impedisce anche alle proteine di attaccarsi alla superficie.Iniziare pulendo il PDMS per 10 minuti con etanolo e isopropanolo, quindi risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata 3 volte e asciugare. Utilizzare un detergente al plasma per 5 minuti per pulire il PDMS asciutto e polimerizzato. Questo passaggio rende la superficie più idrofila. Quindi, preparare una soluzione silana (98,5% in peso di etanolo, 1 in peso di acido acetico e 0,5% in peso di trimetossisilil propil metacrilato) e immergere il substrato in quella soluzione per 15 minuti per preparare il rivestimento di acrilammide. Risciacquare accuratamente il substrato con acqua deionizzata e immergerlo in una soluzione di acrilammide (2 wt% di soluzione di acrilammide/bis, 2,3 mM TEMED e 3 mM di persolfato di ammonio).NOTA: Questi substrati possono essere conservati a temperatura ambiente ricoperti di soluzione di acrilammide in una capsula di Petri di vetro e devono essere utilizzati entro 2 settimane. Quando è pronto per l’uso, sciacquare la superficie con acqua deionizzata e asciugare con azoto per un uso immediato. Aggiungere la miscela attiva (descritta al punto 2.1.6) nei pozzetti e aggiungere immediatamente olio di silicone sulla parte superiore ad uno spessore di circa 2 mm.NOTA: In questa fase, la miscela attiva sarà inserita tra l’olio e il rivestimento idrofilo sul PDMS, ma sarà ancora in qualche modo tridimensionale. Per spingere ulteriormente il materiale in uno strato 2D, incollare il dispositivo PDMS su un vetrino, posizionarlo in una centrifuga a secchio oscillante e ruotare per 12 minuti a 212 x g. Il dispositivo dovrà essere posizionato in modo tale che l’olio di silicone si trovi sulla parte superiore dello strato acquoso. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3. 3. Preparazione della nematica attiva in geometrie confinate NOTA: La nematica attiva come questo sistema quasi-bidimensionale può essere difficile da confinare in piccole geometrie microfluidiche come pozzi o canali. Qui viene descritto un metodo affidabile per confinare il materiale in pozzetti PDMS di forma diversa. Innanzitutto, progettare uno stampo master per il PDMS. Ciò può essere ottenuto stampando pilastri 3D su un substrato. Dopo la stampa 3D dello stampo principale in resina, pulire con isopropanolo e quindi polimerizzare lo stampo sotto una lampada UV per 45 minuti e in forno a 120 ° C per 2 ore (Figura 4).NOTA: L’indurimento sotto UV e post-polimerizzazione termica migliora la qualità della replicazione in PDMS rimuovendo monomeri e residui di fotoinibitori dalla resina30. Utilizzare lo stampo master per creare pozzi da PDMS. Preparare il PDMS come descritto al punto 2.2.1. Immergere lo stampo principale in PDMS non polimerizzato e polimerizzare per una notte in forno a 60 °C. Al termine della polimerizzazione PDMS, rimuovere con attenzione lo stampo principale e tagliare il PDMS come desiderato per lavorare con i pozzetti (Figura 4). Trattare la superficie PDMS come descritto al punto 2.2.3. Prima dell’esperimento, la superficie può essere fissata a un vetrino con colla epossidica per facilitare l’imaging. Pipettare 1 μL della miscela attiva descritta al punto 2.1.6 sul substrato PDMS e aggiungere immediatamente olio di silicone con viscosità28 100-1000 cSt sopra la goccia di rete attiva. La rete attiva si sposterà nel pozzo; questo processo richiede fino a 60 minuti (Figura 4). Come descritto al punto 2.2.5, la rete 2D può essere migliorata ruotando il pozzetto PDMS nella centrifuga a benna oscillante per 12 minuti a 212 x g.

Representative Results

La figura 1 mostra un’immagine rappresentativa di singoli microtubuli preparati dalla tubulina GMPCPP. L’immagine raffigura microtubuli corti di lunghezze simili (con qualche dispersione presente). Una diluizione sufficiente della soluzione di microtubuli dovrebbe produrre un’immagine di microtubuli ben separati per la verifica della lunghezza. I singoli microtubuli possono essere difficili da immaginare a causa delle loro piccole dimensioni. L’uso di una telecamera ad alta sensibilità progettata per la microscopia a fluorescenza è la soluzione migliore per questa applicazione. La Figura 2 e la Figura 3 mostrano esempi di immagini al microscopio a fluorescenza di esperimenti eseguiti con successo utilizzando rispettivamente il metodo della cella a flusso (sezione 2.1) e il metodo invertito (sezione 2.2). Uno strato nematico attivo ben formato è omogeneo nella tessitura, senza aree vuote significative e difetti topologici mobili presenti. Si noti tuttavia che potrebbero esserci alcuni piccoli vuoti accettabili nei nuclei difettosi. Oltre agli esempi mostrati nella Figura 2 e nella Figura 3, sono stati inclusi tre filmati supplementari (Filmato 1, Filmato 2 e Filmato 3) per dimostrare come il nematico attivo dovrebbe apparire in un esperimento riuscito. Tutti i filmati dimostrano il movimento continuo regolare della fase nematica attiva. Nessuna variazione nella concentrazione di microtubuli è evidente dopo che il materiale ha raggiunto il suo stato stazionario. Finché nel sistema è presente ATP sufficiente, il materiale continuerà a muoversi uniformemente. Figura 1: Immagine al microscopio a fluorescenza dei microtubuli GMPCPP. I microtubuli GMPCPP sono stati marcati al 4% con tubulina di rodamina e polimerizzati per 20 minuti a 37 °C. L’imaging è stato eseguito a temperatura ambiente. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Dinamica dei microtubuli in una cella a flusso. (A) Schema della sezione trasversale della cella di flusso, geometria 1 mm x 18 mm. (B) Schema della vista dall’alto della cella di flusso. (C) Immagine al microscopio a fluorescenza che dimostri l’aspetto tipico della soluzione attiva prima dell’assemblaggio all’interfaccia olio/acqua. (D) Immagine al microscopio a fluorescenza della fase nematica attiva assemblata all’interfaccia olio/acqua all’interno della cella di flusso. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Immagine del microscopio a fluorescenza che mostra un nematico attivo preparato con il metodo invertito. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Diagramma di flusso che illustra il metodo per il confinamento nematico attivo in un pozzo PDMS, compresa la fabbricazione di stampi e il trattamento superficiale. Barra della scala sull’immagine a destra (materiale attivo confinato) = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Filmato 1: Risultato rappresentativo per il nematico attivo preparato utilizzando il metodo della cella di flusso. Clicca qui per scaricare questo film. Filmato 2: Risultato rappresentativo per il nematico attivo preparato utilizzando il metodo invertito. Clicca qui per scaricare questo film. Filmato 3: Risultato rappresentativo per il nematico attivo preparato usando il metodo invertito confinato in un pozzo ellittico. Clicca qui per scaricare questo film.

Discussion

Ci sono alcuni punti in tutti i protocolli in cui lo sperimentatore può fare alcuni controlli importanti. Prima di riempire uno dei dispositivi con materiale attivo, è necessario utilizzare la microscopia a fluorescenza (vedi Figura 1) per verificare che i microtubuli siano polimerizzati e idealmente ~ 2-3 μm di lunghezza. Se i microtubuli non sono visibili al microscopio, potrebbero essersi depolimerizzati e il nematico attivo non si formerà. Poiché i singoli microtubuli sono molto piccoli, può essere difficile osservarli direttamente attraverso il microscopio. In questo studio, una telecamera a fluorescenza di alta qualità progettata per applicazioni impegnative in condizioni di scarsa illuminazione è stata utilizzata con il software associato per verificare la crescita del filamento. Aggregati fluorescenti significativi non dovrebbero essere presenti in questa fase, poiché ciò potrebbe indicare la depolimerizzazione o la presenza di proteine denaturate. È anche una buona idea fare un semplice vetrino di prova del microscopio combinando microtubuli, MIX e ATP negli stessi rapporti descritti nei protocolli. L’attività dovrebbe iniziare combinando i componenti e il materiale dovrebbe apparire simile a quello mostrato nella Figura 2C con fasci presenti e movimenti di filamento evidenti visibili ovunque.

Quando si utilizza il metodo della cella di flusso, il tempo di centrifuga e l’orientamento della cella di flusso sono importanti per la formazione di uno strato attivo uniforme. Questo passaggio può richiedere una messa a punto a seconda del tipo di centrifuga utilizzata. La centrifugazione della cella di flusso con il piano attivo orientato perpendicolarmente al piano di rotazione dà i migliori risultati in quanto il materiale può essere spinto uniformemente sull’interfaccia del fluido. Controllare che la cella di flusso sia accuratamente sigillata prima della centrifugazione.

Quando si utilizza il metodo invertito per produrre nematica attiva confinata ci sono diversi passaggi da ottimizzare. Innanzitutto, è importante utilizzare un metodo di stampa 3D che produca strutture ad alta risoluzione. Le pareti laterali irregolari possono causare la cattura dei microtubuli, che interromperà i flussi. I pozzi non dovrebbero essere troppo profondi (in questo studio sono stati utilizzati pozzi profondi 150-200 μm con uno strato di petrolio sovrastante di 2 mm di spessore). Gli sperimentatori potrebbero dover regolare leggermente questi parametri per tentativi ed errori per ottenere il miglior risultato.

Il metodo della cella a flusso e il metodo invertito sono stati utilizzati da diversi autori per esaminare una varietà di effetti che influiscono sui flussi attivi, compresi diversi oli12 e strutture sommerse13. La scelta del metodo dipende dall’obiettivo sperimentale. Utilizzando il metodo della cella a flusso, l’imaging ottico dall’alto dello strato attivo è più chiaro rispetto al metodo invertito a causa dei diversi fluidi sovrastanti. Nel metodo della cella di flusso, l’imaging viene eseguito attraverso un vetrino di copertura e un sottile strato di acqua, mentre il metodo invertito è progettato per avere lo strato di olio in cima. Ciò significa che è necessario un obiettivo a lunga distanza di lavoro per il metodo invertito e la qualità dell’immagine è ridotta. Le differenze di qualità dell’immagine possono essere viste confrontando rispettivamente la Figura 2D (metodo della cella di flusso) e la Figura 3 (metodo invertito) e il filmato 1 e il filmato 2. Per la Figura 3 era necessaria una lente di ingrandimento inferiore con una distanza di lavoro maggiore rispetto a quella utilizzata per la Figura 2. Questi svantaggi di imaging per il metodo invertito possono essere evitati se è disponibile un microscopio invertito adatto, combinato con obiettivi con una distanza di lavoro appropriata per i substrati del vetrino del microscopio. Il vetro più sottile può essere utilizzato come substrato per consentire l’uso di obiettivi di distanza di lavoro standard.

Come vantaggio, la geometria invertita consente l’uso di una gamma più ampia di viscosità dell’olio, non richiede necessariamente la centrifugazione a benna oscillante (se questa non è disponibile) e la preparazione del sistema è relativamente più semplice una volta preparato lo stampo. Tuttavia, per il confinamento nei pozzi utilizzando il metodo invertito, una certa centrifugazione può essere importante per ottenere il materiale in uno strato 2D ben definito.

Il metodo della cella a flusso è stato recentemente utilizzato con grande successo in esperimenti in cui è richiesto uno strato attivo continuo. Il nostro recente lavoro ha esaminato la dinamica dei difetti topologici nello strato attivo, dove l’imaging di alta qualità e l’analisi della trama sono importanti19. Inoltre, il metodo delle celle a flusso è stato utilizzato per studiare gli effetti delle microstrutture sommerse dal petrolio sui flussi attivi16 e sui pilastri per intrappolare i difetti nei flussi attivi31. Questo metodo funziona molto bene per la formazione di uno strato attivo continuo e la qualità dell’immagine è eccellente. Tuttavia, la fase di centrifugazione utilizzata per produrre lo strato attivo 2D finale può essere difficile da eseguire e le celle di flusso sono soggette a perdite e bolle d’aria. Il metodo invertito è un’alternativa molto utile con un alto tasso di successo, è facile da costruire e può essere utilizzato per qualsiasi modello di substrato o geometria a condizione che sia possibile creare uno stampo principale stampato in 3D ad alta risoluzione. Questo metodo è utile anche per osservare gli effetti del confinamento geometrico sulla dinamica nematica attiva perché rende relativamente semplice il riempimento dei pozzi.

In questo articolo, sono descritti due modi per formare un nematico attivo da microtubuli e motori kinesin, oltre a una tecnica per confinare i materiali nei pozzi. Il sistema presentato rappresenta l’esempio più pulito di una fase nematica attiva attualmente in letteratura ed è stato riprodotto da diversi gruppi in tutto il mondo. Il significato di questo materiale non risiede solo nelle origini biologiche dei suoi componenti, ma anche perché apre una direzione completamente nuova nei fluidi attivi ordinati. Lavorando con questo sistema e chiarendo le sue proprietà fondamentali, gli scienziati possono muoversi verso la progettazione di fasi attive completamente sintetiche.

Gli esperimenti focalizzati sugli effetti del confinamento sulla nematica attiva hanno il potenziale per rispondere a domande fondamentali riguardanti il comportamento dei flussi attivi e la dinamica dei difetti topologici sotto confinamento topologico. Il metodo qui presentato aiuterà nell’esecuzione di una varietà di esperimenti incentrati sulla geometria e nella loro analisi, compresa la microfluidica e la miscelazione attiva.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano riconoscere il premio DMR-1808926 della National Science Foundation (NSF) per i generosi finanziamenti. Il progetto è stato sostenuto anche dalla NSF attraverso il Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines presso l’Università della California Merced (HRD-1547848) e il Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vorremmo ringraziare il Dr. Bin Liu dell’Università della California Merced per l’assistenza nella stampa 3D dello stampo e il Dr. Jordi Ignes per la consulenza scientifica durante lo sviluppo del metodo sperimentale invertito.

Materials

20 kD PEG (polyethylene glycol)) Sigma Aldrich 1419109 Depletion agent
CAS Number: 125061-88-3
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514-50ML CAS Number: 2530-85-0
3D printer & Resin Phrozen Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin
40% Acrylamide Solution BIO-RAD 1610140 CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1
Acetic Acid Fisher CAS Number: 64-19-7
Acetone Sigma Aldrich CAS Number: 67-64-1
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) Grace Bio-Labs 620001 SecureSeal
Ammonium Persulfate Sigma Aldrich A3678 CAS Number: 7727-54-0
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) Aquapel Glass Treatment hydrophobic glass treatment
ATP (Adenosine triphosphate) Sigma Aldrich A1852 CAS Number: 34369-07-8
Beakers VWR
Catalase Sigma Aldrich C9322 CAS Number: "9001-05-2"
Desiccator Bel-art
Digital CMOS camera Hamamatsu ORCA – Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol) Sigma Aldrich D9779 CAS Number: "3483-12-3"
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) Sigma Aldrich MFCD00004291 CAS Number: 67-42-5
Ethanol Sigma Aldrich CAS Number: 64-17-5
Fluorescence microscope Leica DM 2500P
Glass Coverslips VWR 48368-040
Glass Slides VWR 16004-430
Glucose Sigma Aldrich G7021 CAS Number: 50-99-7
Glucose Oxidase Sigma Aldrich 345386 CAS Number: 9001-37-0
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) Jena Bioscience NU-405S CAS Number: 14997-54-7
HFE7500 Oil 3M
Hot Plate Fisher Scientific Thermix hot plate model 100M
Isopropyl Alcohol VWR
KCl (potassium chloride) Sigma Aldrich P5405 CAS Number: 7447-40-7
Methanol Sigma Aldrich CAS Number: 67-56-1
MgCl2 (Magnesium Chloride) Sigma Aldrich 208337 CAS Number: 7786-30-3
Microcentrifuge tubes Eppendorf – Thermo Fisher 1.5 mL
Nanopure water purifier Sartorius arium mini
NaOH (Sodium hydroxide) Sigma Aldrich SX0603 CAS Number: 1310-73-2
Petri Dishes VWR
PH Meter Thermo Scientist Orion 3 STAR
Phosphoenol-pyruvate (PEP) Sigma Aldrich MFCD00044476 CAS Number: 4265-07-0
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) Sigma Aldrich CAS Number: 5625-37-6
Pipettes (0.2 – 1000 µl) VWR
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 2594628
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) Sigma Aldrich CAS Number: 63148-52-7
Streptavidin Thermofisher S888
Swinging Bucket Centrifuge Thermo Scientist Sorvall legend RT+
Sylgard 184 Elastomer base World Precision Instruments SYLG184
Sylgard 184 Elastomer Curing agent World Precision Instruments SYLG184
Table top centrifuge Eppendorf MiniSpin Plus
TEMED (Tetramethylethylenediamine) BIO-RAD 1610800 CAS Number: 110-18-9
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) Sigma Aldrich MFCD00006846 CAS Number: 53188-07-1
Tubulin Cytoskeleton T240-B
Tubulin (Rhodamine labeled) Cytoskeleton TL590M-A
Ultracentrifuge Beckman Optima Max-TL
UV Light RapidFix
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) RapidFix
Water Bath Thelco
Whatman Filter paper Sigma Aldrich WHA1001325
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References

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Memarian, F. L., Khaladj, D. A., Hammar, D., Hirst, L. S. Forming, Confining, and Observing Microtubule-Based Active Nematics. J. Vis. Exp. (191), e64287, doi:10.3791/64287 (2023).
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