Condiciones experimentales modificadas para la pérdida de audición inducida por ruido en ratones y evaluación de la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un modelo de ratón de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). Para inducir el NIHL, desarrollamos un dispositivo nuevo y sencillo que utiliza plástico corrugado, una jaula trampa para ratas y un altavoz. Se emplearon imágenes de inmunofluorescencia y respuesta auditiva del tronco encefálico para evaluar la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas, respectivamente.
Abstract
Un modelo animal de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL, por sus siglas en inglés) es útil para que los patólogos, terapeutas, farmacólogos e investigadores de la audición comprendan a fondo el mecanismo de NIHL y, posteriormente, optimicen las estrategias de tratamiento correspondientes. Este estudio tiene como objetivo crear un protocolo mejorado para desarrollar un modelo de ratón de NIHL. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J. Los ratones no anestesiados fueron expuestos a ruidos fuertes (1 y 6 kHz, presentados simultáneamente a 115-125 dB SPL-A) de forma continua durante 6 h al día durante 5 días consecutivos. La función auditiva se evaluó 1 día y 1 semana después de la exposición al ruido, utilizando la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR). Después de la medición de ABR, los ratones fueron sacrificados y sus órganos de Corti fueron recolectados para la tinción de inmunofluorescencia. A partir de las mediciones de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR), se observó una pérdida auditiva significativa 1 día después de la exposición al ruido. Después de 1 semana, los umbrales de audición de los ratones experimentales disminuyeron a ~80 dB SPL, que seguía siendo un nivel significativamente más alto que el de los ratones de control (~40 dB SPL). A partir de los resultados de las imágenes de inmunofluorescencia, se demostró que las células ciliadas externas (OHC) estaban dañadas. En resumen, creamos un modelo de NIHL utilizando ratones machos C57BL/6J. Se desarrolló y luego se empleó un dispositivo nuevo y sencillo para generar y emitir ruido de tonos puros. Las mediciones cuantitativas de los umbrales de audición y la confirmación morfológica del daño de la OHC demostraron que el ruido aplicado indujo con éxito una pérdida auditiva esperada.
Introduction
Alrededor de 1.300 millones de personas en todo el mundo sufren pérdida de audición debido ala exposición al ruido. En este estudio, nuestro objetivo fue establecer un proceso claro paso a paso para inducir y confirmar la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). La NIHL es el resultado de una degeneración/destrucción de las células ciliadas (HC) y de las neuronas ganglionares espirales (SGN), daño en los estereocilios de HC y/o pérdida de sinapsis entre las HC internas de la coclear y las SGN. Tales anomalías también pueden causar tinnitus y deterioro de la percepción del habla (especialmente en un entorno acústico complejo) además de NIHL. Las funciones sociales, psicológicas y cognitivas pueden verse afectadas secuencialmente por estas deficiencias fisiológicas 2,3,4,5,6.
En los estudios preclínicos relacionados con NIHL basados en ratones, las cepas de ratón más populares son CBA/CaJ 2,3,6,7 y C57BL/6 4,5,8. Los ratonesmachos 3,4,7, además, son más utilizados que las hembras, ya que el estrógeno tiene un efecto protector sobre la audición. Por lo tanto, en este estudio solo utilizamos ratones machos9. Después de consultar la literatura, elegimos 1 kHz y 6 kHz como frecuencias del ruido aplicado. La intensidad del ruido aplicado fue de 115 dB SPL-A (alrededor de la jaula) a 125 dB SPL-A (en el centro de la jaula). Después de exponer a los ratones experimentales al ruido de forma continua durante 6 h al día, durante 5 días consecutivos, un aumento óptimo del umbral auditivo indicó que se generó una extensión óptima de NIHL en los ratones experimentales. Las operaciones para el manejo de los animales, la construcción de la configuración experimental y la inducción del ruido se describen claramente paso a paso en el protocolo proporcionado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El NIHL se puede dividir en dos tipos: NIHL temporal, que muestra un cambio temporal del umbral de audición, y NIHL permanente, que se caracteriza por un cambio permanente del umbral de audición. Se cree que la pérdida auditiva que observamos en el sexto día (1 día después de la exposición al ruido) es una combinación de estos dos tipos. En este caso, el umbral auditivo mostraría una recuperación gradual a lo largo del tiempo debido al componente temporal de la pérdida auditiva. En nuestros estudios…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) del Gobierno de Taiwán (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) y las becas de investigación intramuros del Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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