Модифицированные экспериментальные условия для потери слуха, вызванной шумом, у мышей и оценка слуховой функции и повреждения наружных волосковых клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для мышиной модели потери слуха, вызванной шумом (NIHL). Чтобы вызвать NIHL, мы разработали новое и простое устройство с использованием гофрированного пластика, клетки-ловушки для крыс и динамика. Слуховой ответ ствола мозга и иммунофлуоресцентная визуализация были использованы для оценки слуховой функции и повреждения наружных волосковых клеток соответственно.
Abstract
Модель потери слуха, вызванной шумом (NIHL) на животных, полезна патологоанатомам, терапевтам, фармакологам и исследователям слуха, чтобы досконально понять механизм NIHL и впоследствии оптимизировать соответствующие стратегии лечения. Это исследование направлено на создание улучшенного протокола для разработки мышиной модели NIHL. В этом исследовании были использованы самцы мышей C57BL/6J. Мышей без анестезии подвергали воздействию громких звуков (1 и 6 кГц, предъявляемых одновременно при 115-125 дБ SPL-A) непрерывно в течение 6 ч в сутки в течение 5 дней подряд. Слуховую функцию оценивали через 1 день и 1 неделю после воздействия шума с помощью слуховой реакции ствола мозга (ABR). После измерения ABR мышей приносили в жертву, а их кортиевские органы собирали для иммунофлуоресцентного окрашивания. По результатам измерений слуховой реакции ствола мозга (ABR) значительная потеря слуха наблюдалась через 1 день после воздействия шума. Через 1 неделю пороги слышимости подопытных мышей снизились до ~80 дБ SPL, что все еще было значительно выше, чем у контрольных мышей (~40 дБ SPL). По результатам иммунофлуоресцентной визуализации было показано, что наружные волосковые клетки (OHC) повреждены. Таким образом, мы создали модель NIHL на самцах мышей C57BL/6J. Было разработано и внедрено новое и простое устройство для генерации и передачи чистотонального шума. Количественные измерения порогов слышимости и морфологическое подтверждение повреждений OHC показали, что приложенный шум успешно индуцировал ожидаемую потерю слуха.
Introduction
Около 1,3 миллиарда человек во всем мире страдают от потери слуха из-завоздействия шума1. В этом исследовании мы стремились установить четкий пошаговый процесс индуцирования и подтверждения потери слуха, вызванной шумом (NIHL). NIHL возникает в результате дегенерации/разрушения волосковых клеток (HC) и спиральных ганглиозных нейронов (SGN), повреждения стереоцилии HC и/или потери синапсов между внутренними HC улитки и SGN. Такие аномалии могут также вызывать шум в ушах и нарушение восприятия речи (особенно в сложной акустической среде), помимо NIHL. Социальные, психологические и когнитивные функции могут быть последовательно затронуты этими физиологическими недостатками 2,3,4,5,6.
В доклинических исследованиях на мышах, связанных с NIHL, наиболее популярными штаммами мышей являются CBA/CaJ 2,3,6,7 и C57BL/6 4,5,8. Кроме того, самцы мышей 3,4,7 используются чаще, чем самки, так как эстроген оказывает защитное действие на слух. Поэтому в этом исследовании мы использовали только самцов мышей9. Обратившись к литературе, в качестве частот прикладываемого шума мы выбрали 1 кГц и 6 кГц. Интенсивность подаваемого шума составляла от 115 дБ SPL-A (окружающего клетку) до 125 дБ SPL-A (в центре клетки). После непрерывного воздействия шума на подопытных мышей в течение 6 ч в день в течение 5 дней подряд оптимальное повышение порога слуха указывало на то, что у подопытных мышей была сформирована оптимальная степень NIHL. Операции по обращению с животными, построению экспериментальной установки и созданию шума четко описаны шаг за шагом в прилагаемом протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
NIHL можно разделить на два типа: временный NIHL, который показывает временное смещение порога слышимости, и постоянный NIHL, который характеризуется постоянным сдвигом порога слышимости. Считается, что потеря слуха, которую мы наблюдали на6-й день (1 день после воздействия шума), являет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим гранты Министерства науки и технологий (MOST) правительства Тайваня (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) и гранты на проведение исследований от Медицинского колледжа Маккея (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
- World Report on Hearing. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021)
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063 (2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -. S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254 (2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -. K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189 (2019).
