マウスの騒音性難聴の実験条件の修正と聴力機能と外有毛細胞損傷の評価
Summary
ここでは、騒音性難聴(NIHL)のマウスモデルのプロトコルを提示します。NIHLを誘導するために、波形プラスチック、ラットトラップケージ、スピーカーを使用した新しいシンプルなデバイスを開発しました。聴覚脳幹反応と免疫蛍光イメージングを使用して、それぞれ聴覚機能と外有毛細胞の損傷を評価しました。
Abstract
騒音性難聴(NIHL)の動物モデルは、病理学者、セラピスト、薬理学者、および聴覚研究者がNIHLのメカニズムを完全に理解し、その後対応する治療戦略を最適化するのに役立ちます。この研究は、NIHLのマウスモデルを開発するための改良されたプロトコルを作成することを目的としています。この研究では、雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。麻酔をかけていないマウスを、大きな騒音(1および6kHz、115〜125dB SPL−Aで同時に提示)に1日6時間連続して5日間連続して曝露した。聴覚機能は、聴覚脳幹反応(ABR)を使用して、騒音曝露の1日後および1週間後に評価されました。ABR測定後、マウスを屠殺し、免疫蛍光染色のためにコルチの器官を採取した。聴性脳幹反応(ABR)測定から、騒音曝露の1日後に重大な難聴が観察されました。1週間後、実験マウスの聴力閾値は~80 dB SPLに低下し、対照マウス(~40 dB SPL)よりも有意に高いレベルであった。免疫蛍光イメージングの結果から、外有毛細胞(OHC)が損傷していることが示されました。要約すると、雄のC57BL / 6Jマウスを使用してNIHLのモデルを作成しました。純音ノイズを生成・配信するための新しいシンプルな装置を開発し、採用しました。聴力閾値の定量的測定とOHC損傷の形態学的確認は、いずれも印加された騒音が予想される難聴を誘発することに成功したことを示した。
Introduction
世界中で約13億人が騒音曝露による難聴に苦しんでいます1。本研究では,騒音性難聴(NIHL)の誘導・確認プロセスを明確に確立することを目的とした。NIHLは、有毛細胞(HC)およびらせん神経節ニューロン(SGN)の変性/破壊、HCステレオ繊毛の損傷、および/または蝸牛内部HCとSGNの間のシナプスの喪失に起因します。このような異常は、NIHLに加えて、耳鳴りや音声知覚障害(特に複雑な音響環境)を引き起こす可能性もあります。社会的、心理的、および認知機能は、これらの生理学的欠陥によって順次影響を受ける可能性があります2,3,4,5,6。
マウスを用いたNIHL関連の前臨床試験では、最も一般的なマウス系統はCBA/CaJ 2,3,6,7およびC57BL/6 4,5,8です。さらに、雄の3,4,7匹のマウスは、エストロゲンが聴覚を保護する効果があるため、雌のマウスよりも一般的に使用されています。したがって、この研究では雄マウスのみを使用しました9。文献を参照した後、印加ノイズの周波数として1kHzと6kHzを選択しました。印加されたノイズの強度は、115 dB SPL-A(ケージの周囲)から125 dB SPL-A(ケージの中央)でした。実験マウスを1日当たり6時間連続して騒音にさらした後、5日間連続して、聴覚閾値の最適な増加は、NIHLの最適な範囲が実験マウスにおいて生成されたことを示した。動物の取り扱い、実験セットアップの構築、およびノイズの誘導のための操作はすべて、提供されたプロトコルで段階的に明確に説明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
NIHLは、聴力閾値の時間的シフトを示す一時的なNIHLと、永続的な聴力閾値シフトを特徴とする永続的なNIHLの2つのタイプに分けることができます。6日目 (騒音曝露の1日後)に観察された難聴は、これら2つのタイプの組み合わせであると考えられています。この場合、聴力閾値は、難聴の時間的要素のために、時間の経過とともに徐々に回復します。我々の予備的な実験的研究では、同?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
台湾政府の科学技術部(MOST)からの助成金(MOST 110-2314-B-715-005、MOST 111-2314-B-715-009-MY3)、およびマッカイ医科大学(MMC-RD-110-1B-P030、MMC-RD-111-CF-G002-03)からの壁内研究助成金に感謝します。
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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