Condizioni sperimentali modificate per la perdita dell'udito indotta dal rumore nei topi e valutazione della funzione uditiva e del danno esterno delle cellule ciliate
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per un modello murino di perdita dell’udito indotta dal rumore (NIHL). Per indurre NIHL, abbiamo sviluppato un nuovo e semplice dispositivo utilizzando plastica ondulata, una gabbia trappola per topi e un altoparlante. La risposta uditiva del tronco cerebrale e l’imaging immunofluorescenza sono stati impiegati per valutare rispettivamente la funzione uditiva e il danno esterno delle cellule ciliate.
Abstract
Un modello animale di perdita dell’udito indotta dal rumore (NIHL) è utile per patologi, terapisti, farmacologi e ricercatori dell’udito per comprendere a fondo il meccanismo della NIHL e successivamente ottimizzare le strategie di trattamento corrispondenti. Questo studio mira a creare un protocollo migliorato per lo sviluppo di un modello murino di NIHL. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J. I topi non anestetizzati sono stati esposti a rumori forti (1 e 6 kHz, presentati simultaneamente a 115-125 dB SPL-A) continuamente per 6 ore al giorno per 5 giorni consecutivi. La funzione uditiva è stata valutata 1 giorno e 1 settimana dopo l’esposizione al rumore, utilizzando la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR). Dopo la misurazione ABR, i topi sono stati sacrificati e i loro organi di Corti sono stati raccolti per la colorazione con immunofluorescenza. Dalle misurazioni della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR), è stata osservata una significativa perdita dell’udito 1 giorno dopo l’esposizione al rumore. Dopo 1 settimana, le soglie uditive dei topi sperimentali sono diminuite a ~ 80 dB SPL, che era ancora un livello significativamente più alto rispetto ai topi di controllo (~ 40 dB SPL). Dai risultati dell’imaging a immunofluorescenza, le cellule ciliate esterne (OHC) hanno dimostrato di essere danneggiate. In sintesi, abbiamo creato un modello di NIHL utilizzando topi maschi C57BL / 6J. Un nuovo e semplice dispositivo per generare e fornire rumore a tono puro è stato sviluppato e poi impiegato. Le misurazioni quantitative delle soglie uditive e la conferma morfologica del danno OHC hanno entrambe dimostrato che il rumore applicato ha indotto con successo una perdita uditiva attesa.
Introduction
Circa 1,3 miliardi di persone in tutto il mondo soffrono di perdita dell’udito a causa dell’esposizione al rumore1. In questo studio, abbiamo mirato a stabilire un chiaro processo passo-passo per indurre e confermare la perdita dell’udito indotta dal rumore (NIHL). La NIHL deriva da una degenerazione/distruzione delle cellule ciliate (HC) e dei neuroni gangliari spiralati (SGN), danni alle stereociglia HC e/o perdita di sinapsi tra gli HC interni cocleari e gli SGN. Tali anomalie possono anche causare acufene e alterata percezione del linguaggio (specialmente in un ambiente acustico complesso) oltre alla NIHL. Le funzioni sociali, psicologiche e cognitive possono essere sequenzialmente influenzate da queste carenze fisiologiche 2,3,4,5,6.
Negli studi preclinici correlati alla NIHL basati sui topi, i ceppi murini più popolari sono CBA/CaJ 2,3,6,7 e C57BL/6 4,5,8. I topi maschi 3,4,7, inoltre, sono più comunemente usati di quelli femminili, poiché gli estrogeni hanno un effetto protettivo sull’udito. Pertanto, abbiamo usato solo topi maschi in questo studio9. Dopo aver fatto riferimento alla letteratura, abbiamo scelto 1 kHz e 6 kHz come frequenze del rumore applicato. L’intensità del rumore applicato era di 115 dB SPL-A (che circonda la gabbia) a 125 dB SPL-A (al centro della gabbia). Dopo aver esposto i topi sperimentali al rumore continuamente per 6 ore al giorno, per 5 giorni consecutivi, un aumento ottimale della soglia uditiva ha indicato che è stata generata un’estensione ottimale di NIHL nei topi sperimentali. Le operazioni per la manipolazione degli animali, la costruzione della configurazione sperimentale e l’induzione del rumore sono tutte chiaramente descritte passo dopo passo nel protocollo fornito.
Protocol
Representative Results
Discussion
La NIHL può essere suddivisa in due tipi: NIHL temporanea, che mostra uno spostamento temporale della soglia uditiva, e NIHL permanente, che è caratterizzata da uno spostamento permanente della soglia uditiva. Si ritiene che la perdita dell’udito che abbiamo osservato il 6° giorno (1 giorno dopo l’esposizione al rumore) sia una combinazione di questi due tipi. In questo caso, la soglia uditiva mostrerebbe un recupero graduale nel tempo a causa della componente temporale della perdita dell’udito. Nei nostri …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo le sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) del governo di Taiwan (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) e le borse di ricerca intramurali del Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
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