Fluorescerende in situ hybridisatie en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-etikettering voor stamachtige cellen in de hydrozoaire kwal Cladonema pacificum

Cnidaria wordt beschouwd als een basaal vertakkend metazoazuurphylum dat dieren met zenuwen en spieren bevat, waardoor ze in een unieke positie verkeren om de evolutie van de ontwikkeling en fysiologie van dieren^{te begrijpen 1,2}. Cnidarians zijn onderverdeeld in twee hoofdgroepen: Anthozoa (bijv. Zeeanemonen en koralen) bezitten alleen planulalarven en sessiele poliepstadia, terwijl Medusozoa (leden van Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa en Cubozoa) meestal de vorm aannemen van vrijzwemmende medusae of kwallen, evenals planulalarven en poliepen. Cnidarians vertonen vaak een hoge regeneratieve capaciteit en hun onderliggende cellulaire mechanismen, met name hun bezit van volwassen stamcellen en proliferatieve cellen, hebben veel aandacht getrokken ^3,4. Hydrozoaire stamcellen, die aanvankelijk in Hydra werden geïdentificeerd, bevinden zich in de interstitiële ruimtes tussen ectodermale epitheelcellen en worden gewoonlijk interstitiële cellen of i-cellen^{genoemd 3}.

Hydrozoaire i-cellen delen gemeenschappelijke kenmerken, waaronder multipotentie, de expressie van breed geconserveerde stamcelmarkers (bijv. Nanos, Piwi, Vasa) en migratiepotentieel 3,5,6,7,8. Als functionele stamcellen zijn i-cellen uitgebreid betrokken bij de ontwikkeling, fysiologie en omgevingsreacties van hydrozoïsche dieren, wat getuigt van hun hoge regeneratieve capaciteit en plasticiteit³. Hoewel stamcellen, vergelijkbaar met i-cellen, niet buiten hydrozoën zijn geïdentificeerd, zijn zelfs in de gevestigde modelsoort Nematostella nog steeds proliferatieve cellen betrokken bij het onderhoud en de regeneratie van somatisch weefsel, evenals de kiembaan⁹. Aangezien studies in cnidarian ontwikkeling en regeneratie voornamelijk zijn uitgevoerd op poliepachtige dieren zoals Hydra, Hydractinia en Nematostella, blijven de cellulaire dynamiek en functies van stamcellen in kwallensoorten grotendeels onbesproken.

De hydrozoïsche kwal Clytia hemisphaerica, een kosmopolitische kwallensoort met verschillende habitats over de hele wereld, waaronder de Middellandse Zee en Noord-Amerika, is gebruikt als een experimenteel modeldier in verschillende ontwikkelings- en evolutionaire studies¹⁰. Met zijn kleine formaat, eenvoudige bediening en grote eieren is Clytia geschikt voor laboratoriumonderhoud, evenals voor de introductie van genetische hulpmiddelen zoals de onlangs gevestigde transgenese- en knock-outmethoden¹¹, waardoor de mogelijkheid wordt geopend voor gedetailleerde analyse van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de kwallenbiologie. In de Clytia medusa-tentakel zijn i-cellen gelokaliseerd in het proximale gebied, de bol genaamd, en voorlopercellen zoals nematoblasten migreren naar de distale punt terwijl ze zich onderscheiden in verschillende celtypen, waaronder nematocyten¹².

Tijdens regeneratie van het Clytia-manubrium migreren het orale orgaan van kwallen, Nanos1 ⁺ i-cellen die aanwezig zijn in de geslachtsklieren naar het gebied waar het manubrium verloren gaat als reactie op schade en nemen deel aan de regeneratie van het manubrium⁷. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat i-cellen in Clytia zich ook gedragen als functionele stamcellen die betrokken zijn bij morfogenese en regeneratie. Aangezien de eigenschappen van i-cellen echter verschillen tussen representatieve poliepachtige dieren zoals Hydra en Hydractinia³, is het mogelijk dat de kenmerken en functies van stamcellen gediversifieerd zijn tussen kwallensoorten. Bovendien zijn, met uitzondering van Clytia, experimentele technieken beperkt voor andere kwallen en is de gedetailleerde dynamiek van proliferatieve cellen en stamcellen onbekend¹³.

De hydrozoïsche kwal Cladonema pacificum is een opkomend modelorganisme dat in een laboratoriumomgeving kan worden gehouden zonder waterpomp of filtratiesysteem. De Cladonema medusa heeft vertakte tentakels, een gemeenschappelijk kenmerk in de Cladonematidae-familie, en een fotoreceptororgaan genaamd de ocellus op de ectodermale laag bij de bol¹⁴. Het tentakelvertakkingsproces vindt plaats op een nieuwe vertakkingsplaats die langs de adaxiale kant van de tentakel verschijnt. Na verloop van tijd blijven de tentakels uitrekken en vertakken, waarbij de oudere takken naar de punt¹⁵ worden geduwd. Bovendien kunnen Cladonema-tentakels binnen enkele dagen na amputatie regenereren. Recente studies hebben de rol van prolifererende cellen en stamachtige cellen in tentakelvertakking en regeneratie in Cladonema ^16,17 gesuggereerd. Hoewel conventionele in situ hybridisatie (ISH) is gebruikt om genexpressie in Cladonema te visualiseren, is het vanwege de lage resolutie momenteel moeilijk om stamceldynamica op cellulair niveau in detail te observeren.

Dit artikel beschrijft een methode voor het visualiseren van stamachtige cellen in Cladonema door FISH en co-kleuring met EdU, een marker van celproliferatie¹⁸. We visualiseren het expressiepatroon van Nanos1, een stamcelmarker ^5,17, door FISH, die de identificatie van stamachtige celverdeling op het niveau van één cel mogelijk maakt. Bovendien maakt de co-kleuring van Nanos1-expressie met EdU-etikettering het mogelijk om actief prolifererende stamachtige cellen te onderscheiden. Deze methode voor het monitoren van zowel stamachtige cellen als proliferatieve cellen kan worden toegepast op een breed scala aan onderzoeksgebieden, waaronder tentakelvertakking, weefselhomeostase en orgaanregeneratie in Cladonema, en een vergelijkbare aanpak kan worden toegepast op andere kwallensoorten.