Summary

التهجين الفلوري في الموقع ووضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine للخلايا الشبيهة بالجذعية في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum

Published: August 03, 2022
doi:

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.

Abstract

يظهر Cnidarians ، بما في ذلك شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية وقناديل البحر ، مورفولوجيا وأنماط حياة متنوعة تتجلى في الاورام الحميدة اللاطئة و medusae السباحة الحرة. كما يتضح من النماذج الراسخة مثل Hydra و Nematostella ، تساهم الخلايا الجذعية و / أو الخلايا التكاثرية في تطوير وتجديد الاورام الحميدة cnidarian. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية الأساسية في معظم قناديل البحر ، وخاصة في مرحلة ميدوسا ، غير واضحة إلى حد كبير ، وبالتالي ، فإن تطوير طريقة قوية لتحديد أنواع معينة من الخلايا أمر بالغ الأهمية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum. تمتلك Cladonema medusae مخالب متفرعة تنمو باستمرار وتحافظ على قدرتها على التجدد طوال مرحلة البلوغ ، مما يوفر منصة فريدة لدراسة الآليات الخلوية التي تنظمها الخلايا المتكاثرة و / أو الشبيهة بالجذعية. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع (FISH) باستخدام علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، بينما يتيح وضع العلامات النبضية باستخدام 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وهي علامة طور S ، تحديد الخلايا المتكاثرة. من خلال الجمع بين كل من وضع العلامات FISH و EdU ، يمكننا اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع المتكاثرة بنشاط على الحيوانات الثابتة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الحيوانات الأخرى ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر غير النموذجية.

Introduction

تعتبر Cnidaria شعبة metazoan متفرعة بشكل أساسي تحتوي على ذات أعصاب وعضلات ، مما يضعها في وضع فريد لفهم تطور نمو الحيوان وعلم وظائف الأعضاء 1,2. يتم تصنيف Cnidarians إلى مجموعتين رئيسيتين: Anthozoa (على سبيل المثال ، شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية) تمتلك فقط يرقات planula ومراحل polyp sessile ، في حين أن Medusozoa (أعضاء Hydrozoa و Staurozoaو Scyphozoa و Cubozoa) عادة ما تأخذ شكل medusae السباحة الحرة ، أو قنديل البحر ، وكذلك يرقات planula والأورام الحميدة. عادة ما يظهر Cnidarians قدرة عالية على التجدد ، وقد جذبت آلياتهم الخلوية الأساسية ، وخاصة امتلاكهم للخلايا الجذعية البالغة والخلايا التكاثرية ، الكثير من الاهتمام 3,4. تم تحديد الخلايا الجذعية الهيدروزوانية في البداية في هيدرا ، وتقع في الفراغات الخلالية بين الخلايا الظهارية الأديم الظاهر ويشار إليها عادة باسم الخلايا الخلالية أو الخلايا i3.

تشترك خلايا Hydrozoan i في خصائص مشتركة تشمل تعدد القدرات ، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية المحفوظة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، Nanos ، Piwi ، Vasa) ، وإمكانية الهجرة3،5،6،7،8. كخلايا جذعية وظيفية ، تشارك الخلايا i على نطاق واسع في التطور وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات البيئية للحيوانات الهيدروزوانية ، مما يشهد على قدرتها العالية على التجدد واللدونة3. في حين أن الخلايا الجذعية ، على غرار الخلايا i ، لم يتم تحديدها خارج الهيدروزوان ، حتى في الأنواع النموذجية الراسخة Nematostella ، لا تزال الخلايا التكاثرية تشارك في صيانة وتجديد الأنسجة الجسدية ، وكذلك الخط الجرثومي9. نظرا لأن الدراسات في التطور والتجديد cnidarian قد أجريت في الغالب على من نوع polyp مثل Hydra و Hydractinia و Nematostella ، فإن الديناميات الخلوية ووظائف الخلايا الجذعية في أنواع قناديل البحر لا تزال دون معالجة إلى حد كبير.

تم استخدام قنديل البحر الهيدروزواني Clytia hemisphaerica ، وهو نوع من قناديل البحر العالمية ذات الموائل المختلفة حول العالم ، بما في ذلك البحر الأبيض المتوسط وأمريكا الشمالية ، كحيوان نموذجي تجريبي في العديد من الدراسات التنموية والتطورية10. بفضل صغر حجمها وسهولة التعامل معها وبيضها الكبير ، فإن Clytia مناسبة لصيانة المختبر ، وكذلك لإدخال الأدوات الوراثية مثل الجينات المحورة التي تم إنشاؤها مؤخرا وطرق خروج المغلوب11 ، مما يفتح الفرصة لإجراء تحليل مفصل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا قنديل البحر. في مخالب Clytia medusa ، تتمركز الخلايا i في المنطقة القريبة ، والتي تسمى البصلة ، وتهاجر الأسلاف مثل الأرومات الخيطية إلى الطرف البعيد بينما تتمايز إلى أنواع خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا الخيطية12.

أثناء تجديد Clytia manubrium ، العضو الفموي لقناديل البحر ، تهاجر خلايا Nanos1 + i الموجودة في الغدد التناسلية إلى المنطقة التي يفقد فيها manubrium استجابة للضرر وتشارك في تجديد manubrium7. تدعم هذه النتائج فكرة أن الخلايا i في Clytia تتصرف أيضا كخلايا جذعية وظيفية تشارك في التشكل والتجديد. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن خصائص الخلايا i تختلف بين الحيوانات التمثيلية من نوع الاورام الحميدة مثل Hydra و Hydractinia3 ، فمن الممكن أن تتنوع خصائص ووظائف الخلايا الجذعية بين أنواع قناديل البحر. علاوة على ذلك ، باستثناء Clytia ، كانت التقنيات التجريبية محدودة لقناديل البحر الأخرى ، والديناميات التفصيلية للخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير معروفة13.

قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية بدون مضخة مياه أو نظام ترشيح. تحتوي Cladonema medusa على مخالب متفرعة ، وهي سمة مشتركة في عائلة Cladonematidae ، وعضو مستقبلات ضوئية يسمى ocellus على طبقة الأديم الظاهر بالقرب من المصباح14. تحدث عملية تفرع اللامسة في موقع تفرع جديد يظهر على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الطرف15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتجدد مخالب كلادونيما في غضون أيام قليلة عند البتر. اقترحت الدراسات الحديثة دور الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبيهة بالجذع في تفرع اللامسة وتجديدها في Cladonema16,17. ومع ذلك ، في حين تم استخدام التهجين التقليدي في الموقع (ISH) لتصور التعبير الجيني في Cladonema ، نظرا لدقته المنخفضة ، فمن الصعب حاليا مراقبة ديناميكيات الخلايا الجذعية على المستوى الخلوي بالتفصيل.

تصف هذه الورقة طريقة لتصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في Cladonema بواسطة FISH والتلوين المشترك مع EdU ، وهي علامة على تكاثر الخلايا18. نتصور نمط التعبير عن Nanos1 ، وهي علامة الخلايا الجذعية 5,17 ، بواسطة FISH ، والتي تسمح بتحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالجذع على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية على مجموعة واسعة من مناطق التحقيق ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء في كلادونيما ، ويمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع قناديل البحر الأخرى.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. 1. توليف التحقيق استخراج الحمض النووي الريبيضع ثلاثة Cladonema medusae حية مستزرعة في مياه البحر الاصطناعية (ASW) في أنبوب سعة 1.5 مل باس?…

Representative Results

تم استخدام مخالب Cladonema كنموذج لدراسة العمليات الخلوية للتشكل والتجديد15،16،17. يتكون هيكل اللامسة من أنبوب ظهاري حيث توجد خلايا تشبه الساق ، أو الخلايا i ، في المنطقة القريبة ، تسمى لمبة اللامسة ، وتضاف فروع جديدة بالتتابع إلى الجزء الخ…

Discussion

الخلايا المتكاثرة والخلايا الجذعية هي مصادر خلوية مهمة في عمليات مختلفة مثل التشكل والنمو والتجديد21,22. تصف هذه الورقة طريقة للتلوين المشترك لعلامة الخلايا الجذعية Nanos1 بواسطة FISH و EdU وضع العلامات في Cladonema medusae. اقترح العمل السابق باستخدام وضع العلا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل AMED تحت رقم المنحة JP22gm6110025 (إلى Y.N.) ومن قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 22H02762 (إلى Y.N.).

Materials

2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Play Video

Cite This Article
Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

View Video