هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.
يظهر Cnidarians ، بما في ذلك شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية وقناديل البحر ، مورفولوجيا وأنماط حياة متنوعة تتجلى في الاورام الحميدة اللاطئة و medusae السباحة الحرة. كما يتضح من النماذج الراسخة مثل Hydra و Nematostella ، تساهم الخلايا الجذعية و / أو الخلايا التكاثرية في تطوير وتجديد الاورام الحميدة cnidarian. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية الأساسية في معظم قناديل البحر ، وخاصة في مرحلة ميدوسا ، غير واضحة إلى حد كبير ، وبالتالي ، فإن تطوير طريقة قوية لتحديد أنواع معينة من الخلايا أمر بالغ الأهمية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum. تمتلك Cladonema medusae مخالب متفرعة تنمو باستمرار وتحافظ على قدرتها على التجدد طوال مرحلة البلوغ ، مما يوفر منصة فريدة لدراسة الآليات الخلوية التي تنظمها الخلايا المتكاثرة و / أو الشبيهة بالجذعية. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع (FISH) باستخدام علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، بينما يتيح وضع العلامات النبضية باستخدام 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وهي علامة طور S ، تحديد الخلايا المتكاثرة. من خلال الجمع بين كل من وضع العلامات FISH و EdU ، يمكننا اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع المتكاثرة بنشاط على الحيوانات الثابتة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الحيوانات الأخرى ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر غير النموذجية.
تعتبر Cnidaria شعبة metazoan متفرعة بشكل أساسي تحتوي على ذات أعصاب وعضلات ، مما يضعها في وضع فريد لفهم تطور نمو الحيوان وعلم وظائف الأعضاء 1,2. يتم تصنيف Cnidarians إلى مجموعتين رئيسيتين: Anthozoa (على سبيل المثال ، شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية) تمتلك فقط يرقات planula ومراحل polyp sessile ، في حين أن Medusozoa (أعضاء Hydrozoa و Staurozoaو Scyphozoa و Cubozoa) عادة ما تأخذ شكل medusae السباحة الحرة ، أو قنديل البحر ، وكذلك يرقات planula والأورام الحميدة. عادة ما يظهر Cnidarians قدرة عالية على التجدد ، وقد جذبت آلياتهم الخلوية الأساسية ، وخاصة امتلاكهم للخلايا الجذعية البالغة والخلايا التكاثرية ، الكثير من الاهتمام 3,4. تم تحديد الخلايا الجذعية الهيدروزوانية في البداية في هيدرا ، وتقع في الفراغات الخلالية بين الخلايا الظهارية الأديم الظاهر ويشار إليها عادة باسم الخلايا الخلالية أو الخلايا i3.
تشترك خلايا Hydrozoan i في خصائص مشتركة تشمل تعدد القدرات ، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية المحفوظة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، Nanos ، Piwi ، Vasa) ، وإمكانية الهجرة3،5،6،7،8. كخلايا جذعية وظيفية ، تشارك الخلايا i على نطاق واسع في التطور وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات البيئية للحيوانات الهيدروزوانية ، مما يشهد على قدرتها العالية على التجدد واللدونة3. في حين أن الخلايا الجذعية ، على غرار الخلايا i ، لم يتم تحديدها خارج الهيدروزوان ، حتى في الأنواع النموذجية الراسخة Nematostella ، لا تزال الخلايا التكاثرية تشارك في صيانة وتجديد الأنسجة الجسدية ، وكذلك الخط الجرثومي9. نظرا لأن الدراسات في التطور والتجديد cnidarian قد أجريت في الغالب على من نوع polyp مثل Hydra و Hydractinia و Nematostella ، فإن الديناميات الخلوية ووظائف الخلايا الجذعية في أنواع قناديل البحر لا تزال دون معالجة إلى حد كبير.
تم استخدام قنديل البحر الهيدروزواني Clytia hemisphaerica ، وهو نوع من قناديل البحر العالمية ذات الموائل المختلفة حول العالم ، بما في ذلك البحر الأبيض المتوسط وأمريكا الشمالية ، كحيوان نموذجي تجريبي في العديد من الدراسات التنموية والتطورية10. بفضل صغر حجمها وسهولة التعامل معها وبيضها الكبير ، فإن Clytia مناسبة لصيانة المختبر ، وكذلك لإدخال الأدوات الوراثية مثل الجينات المحورة التي تم إنشاؤها مؤخرا وطرق خروج المغلوب11 ، مما يفتح الفرصة لإجراء تحليل مفصل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا قنديل البحر. في مخالب Clytia medusa ، تتمركز الخلايا i في المنطقة القريبة ، والتي تسمى البصلة ، وتهاجر الأسلاف مثل الأرومات الخيطية إلى الطرف البعيد بينما تتمايز إلى أنواع خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا الخيطية12.
أثناء تجديد Clytia manubrium ، العضو الفموي لقناديل البحر ، تهاجر خلايا Nanos1 + i الموجودة في الغدد التناسلية إلى المنطقة التي يفقد فيها manubrium استجابة للضرر وتشارك في تجديد manubrium7. تدعم هذه النتائج فكرة أن الخلايا i في Clytia تتصرف أيضا كخلايا جذعية وظيفية تشارك في التشكل والتجديد. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن خصائص الخلايا i تختلف بين الحيوانات التمثيلية من نوع الاورام الحميدة مثل Hydra و Hydractinia3 ، فمن الممكن أن تتنوع خصائص ووظائف الخلايا الجذعية بين أنواع قناديل البحر. علاوة على ذلك ، باستثناء Clytia ، كانت التقنيات التجريبية محدودة لقناديل البحر الأخرى ، والديناميات التفصيلية للخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير معروفة13.
قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية بدون مضخة مياه أو نظام ترشيح. تحتوي Cladonema medusa على مخالب متفرعة ، وهي سمة مشتركة في عائلة Cladonematidae ، وعضو مستقبلات ضوئية يسمى ocellus على طبقة الأديم الظاهر بالقرب من المصباح14. تحدث عملية تفرع اللامسة في موقع تفرع جديد يظهر على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الطرف15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتجدد مخالب كلادونيما في غضون أيام قليلة عند البتر. اقترحت الدراسات الحديثة دور الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبيهة بالجذع في تفرع اللامسة وتجديدها في Cladonema16,17. ومع ذلك ، في حين تم استخدام التهجين التقليدي في الموقع (ISH) لتصور التعبير الجيني في Cladonema ، نظرا لدقته المنخفضة ، فمن الصعب حاليا مراقبة ديناميكيات الخلايا الجذعية على المستوى الخلوي بالتفصيل.
تصف هذه الورقة طريقة لتصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في Cladonema بواسطة FISH والتلوين المشترك مع EdU ، وهي علامة على تكاثر الخلايا18. نتصور نمط التعبير عن Nanos1 ، وهي علامة الخلايا الجذعية 5,17 ، بواسطة FISH ، والتي تسمح بتحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالجذع على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية على مجموعة واسعة من مناطق التحقيق ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء في كلادونيما ، ويمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع قناديل البحر الأخرى.
الخلايا المتكاثرة والخلايا الجذعية هي مصادر خلوية مهمة في عمليات مختلفة مثل التشكل والنمو والتجديد21,22. تصف هذه الورقة طريقة للتلوين المشترك لعلامة الخلايا الجذعية Nanos1 بواسطة FISH و EdU وضع العلامات في Cladonema medusae. اقترح العمل السابق باستخدام وضع العلا…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل AMED تحت رقم المنحة JP22gm6110025 (إلى Y.N.) ومن قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 22H02762 (إلى Y.N.).
2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
DTT | Promega | P117B | |
ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
Formamide | Wako | 068-00426 | |
Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
NaCl | Wako | 191-01665 | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
tRNA | Roche | 10109541001 | |
TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |