יצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית של עכבר עם כריתת שחלות למחקר דצידואליזציה של רירית הרחם
Summary
במאמר זה נתאר את השיטה ליצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית באמצעות עכבר השחלות, ניסוי נשירת רירית הרחם הקלאסי בתחום המחקר של נשירת רירית הרחם.
Abstract
דצידואליזציה של רירית הרחם היא תהליך התמיינות ייחודי של רירית הרחם, הקשור קשר הדוק לווסת ולהריון. פגיעה בדצידואליזציה מובילה להפרעות רירית הרחם שונות, כגון אי פוריות, הפלות חוזרות ולידה מוקדמת. הפיתוח והשימוש במודל דצידואליזציה של רירית הרחם במחקרי פוריות היו גולת הכותרת עבור חוקרי פוריות במשך זמן רב. העכבר נמצא בשימוש נרחב בחקר רבייה ודצידואליזציה. ישנם שלושה מודלים מבוססים של עכברים בנוגע לדצידוואליזציה, כלומר דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD), דצידואליזציה מלאכותית (AD) ועשריריזציה חוץ גופית (IVD). ביניהם, AD נחשב מודל אמין עבור decidualization עכבר, אשר קל ליישם קרוב NPD. מאמר זה מתמקד בשיטה שונה של תהליך הייצור והיישום של מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר עם כריתת שחלות כדי למנוע השפעות שחלתיות, אשר יכול להשיג תוצאות ניתנות לשחזור עם שונות קטנה בתוך הקבוצה. שיטה זו מספקת מודל טוב ואמין של בעלי חיים לחקר עשרוניות רירית הרחם.
Introduction
עם התפתחות טכנולוגיית הרבייה בסיוע אדם, שיעור ההריונות הקליניים הנוכחי של הפריה חוץ גופית-החזרת עוברים (IVF-ET) הגיע או אפילו עלה על זה של הריון טבעי. למרות זאת, מטופלות רבות בקליניקה של רבייה בסיוע עדיין עוברות החזרות עוברים מרובות אך אינן מצליחות להשיג הריון כרצונן. עם זאת, המנגנון המולקולרי הספציפי שלה עדיין אינו ברור, ולכן התערבות קלינית אינה יעילה, וזה אחד האתגרים המשמעותיים העומדים בפני רפואת הרבייה 1,2.
גורמי רירית הרחם מהווים כשני שלישים מהגורמים לכישלון הפריה חוץ גופית3. השתלת עובר אנושי מחולקת לשלושה שלבים: מיקום, הדבקה ופלישה 4,5,6. רירית הרחם האימהית עוברת סדרה של שינויים כדי לפגוש את הגעתו של העובר. יצירת “תקופת חלון” להשתלה מספקת תנאים נוחים להשתלת עובר 7,8.
ברוב היונקים, לאחר שהבלסטוציסט נצמד לאפיתל הלומינלי של הרחם, תאי הסטרומה המקיפים את הבלסטוציסט מתחילים להתרבות ולהתמיין במהירות, והשיפוץ המהיר של המזנכימה משנה את צורתו ותפקודו, מה שמוביל להשתלת עובר 5,9,10. הגידול המהיר בנפח האתר ובמשקלו מאפשר לבלסטוציסט להשתלב בסטרומה של הרחם, תהליך המכונה דצידואליזציה11. סטרומה רירית הרחם מתמיינת ומתעצבת מחדש לקראת הריון, בעוד המעבר של תאי סטרומה מספק מרחב וחיבורי איתות חדשים לתאים נשירים לבצע את תפקידם12,13. תאי סטרומה הופכים לתאים נשירים ומפרישים גורמים איקוניים רבים כגון פרולקטין (PRL), חלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (Igfbp1) וכן הלאה. מחקרים הראו כי דצידואליזציה חריגה היא אחת הסיבות העיקריות לכישלון השתלת עוברים, אך הסיבה לדצידואליזציה חריגה עדיין אינה ברורה ויש צורך להבהיר אותהעוד יותר 1,14.
מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר חיוני לחקר התהליך הפיזיולוגי והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הדצידואליזציה. דצידואליזציה מלאכותית (AD) מתייחסת בעיקר לתהליך של נשירת רירית הרחם שהוקמה בשיטות מלאכותיות כדי לדמות הריון או את המחזור החודשי. מבחינת מורפולוגיה, אין הבדל כולל בין עשרון הריון לבין דצידואליזציה מלאכותית15,16. בלוטות הרחם קיימות ברירית הרחם לפני שהן נוצרות ונעלמות לאחר העשרה. לגבי ביטוי הגנים, רק הבדל קל מזוהה בין דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD) לבין AD15. כתוצאה מכך, מודל הדצידואליזציה המלאכותית בעכברים יכול לדמות דצידואליזציה של הריון כדי לחקור את הפתוגנזה הלא ידועה וטיפול חדש במחלות רבייה אנושיות.
NPD, AD ודצידואליזציה חוץ גופית (IVD) הן שלוש שיטות להשגת דצידואליזציה של עכברים. מודל NPD תלוי בהריון טבעי והוא הקרוב ביותר למצב הפיזיולוגי של האם, כולל ההשפעות של עוברים. השוואת ההבדלים בין אתרי השתלה ללא השתלה היא גישה פיזיולוגית ונוחה יותר לחקר דצידואליזציה. מודל האלצהיימר פותח על ידי שימוש בהזרקה תוך רחמית של שמן שומשום כממריץ כדי לגרום לדצידואליזציה אצל עכברה מדומה המזווגת עם זכרים שעברו כריתת כלי דם כדי למנוע את ההשפעה של עוברים. הן מודלים של NPD והן של אלצהיימר ממלאים תפקידים חיוניים במטרות מחקר שונות, אך הם אינם יכולים להימנע מכשל הזדווגות ומהבדלים בתוך הקבוצה הנגרמים על ידי פעילויות שונות של מטבוליזם הורמונלי אימהי. IVD היא שיטה התלויה בטיפול בשילוב אסטרוגן ופרוגסטרון ברמה התאית, הדורשת תנאי ניסוי מחמירים יותר ויכולת הפעלה. עם זאת, מודל המבחנה אינו יכול לדמות באופן מלא את התגובה הנשירים בתנאים פיזיולוגיים15. לכן, אנו מציעים שיטת אינדוקציה פשוטה ומשופרת שונה מן AD מסורתי כדי להפחית את ההשפעה של הורמונים אנדוגניים על decidualization. בהתבסס על הבטחת הצלחת השראת הדצידואליזציה, היא קרובה יותר למצב הפיזיולוגי ומתאימה יותר לניסויים שצריכים להוציא גורמים עובריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דצידואליזציה בעכברים היא תהליך ספונטני בהתאם לנוכחות עוברים, השונה מבני אדם. עם זאת, נמצא כי גירוי מלאכותי כגון הזרקת רחם של חרוזי זכוכית וחתך ברחם יכול לגרום לדצידואליזציה של רירית הרחם במקום עוברים. בנוסף, החוקרים מצאו כי גורמים רבים יכולים לגרום לנשירים או להשתתף בדצידואליזציה, כגון הז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להכיר בתמיכה מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82001629, XQS), תוכנית הנוער של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’יאנגסו (BK20200116, XQS), ומימון מחקר פוסט-דוקטורט במחוז ג’יאנגסו (2021K277B, XQS).
Materials
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
- Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).
- Ng, S. W., et al. Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092 (2020).
- Birgit, G., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Paulson, E. E., Comizzoli, P. Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species. Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).
- Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success. Nature Communications. 9 (1), 2435 (2018).
- Tian, J., et al. Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger. Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).
- Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).
- Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions. Gene. 551 (1), 1-14 (2014).
- Jose, R. M., et al. Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity. Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).
- Pan-Castillo, B., et al. Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization. Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).
- Wang, C., et al. Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level. Genes. 11 (8), 935 (2020).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. (121), e55168 (2017).
- Kerger, H., et al. Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia. Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).
- Filant, J., Spencer, T. E. Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus. Biology of Reproduction. 88 (4), 93 (2013).
- Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. EBioMedicine. 75, 103790 (2022).
- Grogg, E., Pearse, A. G. Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase. Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).
- Labarta, E., et al. Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity. Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).
