Измерение термогенеза скелетных мышц у мышей и крыс

В рамках метаболических исследований исследование термогенеза скелетных мышц является многообещающим новым способом исследования гомеостаза массы тела. Опубликованная литература поддерживает идею о том, что термогенные реакции одной из крупнейших систем органов организма — скелетных мышц — обеспечивают путь для увеличения расхода энергии и других метаболических эффектов, тем самым эффективно перебалансируя системы при таких заболеваниях, как ожирение ^1,2,3. Если мышцу можно считать термогенным органом, исследования должны использовать практическую методологию для изучения термогенных изменений в этом органе. Желание понять эндотермическое воздействие скелетных мышц и полезность этой методологии для изучения недрожащего термогенеза мышц не являются специфическими для метаболических исследований. Дисциплины, включая эволюцию⁴, сравнительную физиологию⁵ и экофизиологию ^6,7, проявили личную заинтересованность в понимании того, как термогенез мышц может способствовать эндотермии и как этот механизм адаптируется к окружающей среде. Представленный протокол предоставляет критические методы, необходимые для решения этих вопросов.

Предоставленный метод может быть использован при оценке как контекстуальной, так и фармакологической модуляции мышечной температуры стимулов, включая уникальную технику обеспечения запаха хищника (PO) для смещения контекста для воспроизведения угрозы хищника. Предыдущие отчеты продемонстрировали способность PO быстро индуцировать значительное увеличение мышечного термогенеза⁸. Кроме того, фармакологические стимулы также могут изменять температуру мышц. Это было продемонстрировано в контексте PO-индуцированного мышечного термогенеза, где фармакологическая блокада периферических β-адренорецепторов с использованием надолола ингибировала способность PO индуцировать термогенез мышц, не оказывая существенного влияния на сократительный термогенез во время ходьбы на беговой дорожке⁸. Центральное введение агонистов рецепторов меланокортина у крыс также использовалось для распознавания механизмов мозга, изменяющих термогенез ^9,10.

Здесь представлено предварительное исследование способности нейрогормона окситоцина (Oxt) изменять термогенез мышц у мышей. Подобно угрозе хищника, социальные встречи с однополыми конспецифичными повышают температуру тела, явление, называемое социальной гипертермией¹¹. Учитывая отношение Oxt к социальному поведению¹², было высказано предположение, что Oxt является посредником социальной гипертермии у мышей. Действительно, антагонист рецептора окситоцина уменьшает социальную гипертермию у мышей¹¹, а у детенышей мышей, лишенных Oxt, наблюдается дефицит поведенческих и физиологических аспектов терморегуляции, включая термогенез¹³. Учитывая, что Harshaw et al. (2021) не нашли доказательств, подтверждающих термогенез β3-адренергической рецептор-зависимой коричневой жировой ткани (BAT) с социальной гипертермией¹¹, было высказано предположение, что социальная гипертермия может быть вызвана индункцией мышечного термогенеза Oxt.

Для измерения термогенеза скелетных мышц следующий протокол использует имплантацию предварительно запрограммированных транспондеров IPTT-300, прилегающих к интересующей мышце в мыши или^крысе 8,10,14,15. Эти транспондеры представляют собой стеклянные инкапсулированные микрочипы, которые считываются с помощью соответствующих транспондерных считывателей. Практически никакие исследования не использовали эту технологию в этом качестве, хотя исследования показали необходимость специфичности, обеспечиваемой этим методом ^16,17. Предыдущие исследования показали надежность этого метода и разнообразие способов, с помощью которых могут быть использованы температурные транспондеры по сравнению с другими методами^{температурного тестирования 18} или в сочетании с хирургическими методами (например, канюляция¹⁹). Тем не менее, исследования такого рода полагаются на различные стратегические места для измерения общей температуры тела ^20,21,22 или определенных тканей, таких как BAT 23,24,25.

Вместо того, чтобы измерять температуру в этих местах или при использовании ушных или ректальных термометров²⁶, способ, описанный здесь, обеспечивает специфичность для интересующей мышцы. Способность нацеливаться на участок путем непосредственной имплантации транспондеров, прилегающих к интересующим мышцам, более эффективна для зондирования термогенеза мышц. Он предоставляет новый путь в дополнение к тем, которые обеспечиваются поверхностной инфракрасной термометрией^27,28 или измерениями кожной температуры с помощью ^{термопары 29}. Кроме того, данные, предоставленные с помощью этого метода, предлагают ряд направлений исследований, избегая необходимости в большом, дорогостоящем, высокотехнологичном оборудовании и программном обеспечении, таком как инфракрасная термография 30,31,32.

Этот метод успешно используется для измерения температуры в квадрицепсах и икроножной крупемии, либо в одностороннем, либо в двустороннем порядке. Этот метод также был эффективен в сочетании со стереотаксической хирургией^14,15. В пределах ~ 7-10 см от конечности транспондера портативные считыватели транспондера (DAS-8027 / DAS-7007R) используются для сканирования, измерения и отображения температуры. Это расстояние было критическим и ценным для предыдущих исследований ^{8,9,10, поскольку} оно сводит к минимуму потенциальные стрессоры и изменяющие температуру переменные, такие как обращение с животными во время процедур тестирования. Используя таймеры, измерения могут быть записаны и собраны в течение определенного периода времени без прямого взаимодействия с животными.

Чтобы еще больше свести к минимуму беспокойство мышей во время тестирования, этот метод описывает сборку и использование стояков из труб ПВХ, чтобы дать экспериментатору доступ к нижней части домашних клеток во время тестирования. Используя стояки в тандеме с цифровым считывателем, измерения температуры конечности транспондера могут быть выполнены без какого-либо взаимодействия с животными после размещения стимула. При минимальных затратах этот метод можно использовать совместно с фармакологическими и контекстуальными раздражителями, что делает его вполне доступным для исследователей. Кроме того, этот метод может быть использован со значительным количеством субъектов (~ 16 мышей или ~ 12 крыс) за раз, экономя время на увеличение общей пропускной способности для любого исследовательского проекта.

В этот метод введен созданный механизм для представления запахов мышам с использованием шариков из нержавеющей стали, называемых «чайными шариками». Хотя эти чайные шарики идеально подходят для содержания любого запахового материала, в этих исследованиях полотенца, которые служили постельным бельем в клетке в течение 2-3 недель для хорьков, естественного хищника мышей и крыс, помещаются в каждый лечебный чайный шарик. Каждое полотенце разрезается на квадраты размером 5 см х 5 см. Эта аликвотация также повторяется с идентичными контрольными полотенцами без запаха. Представление этих запахов без барьера (то есть чайного шарика) привело к тому, что мыши измельчали волокна в своих клетках, увеличивая физическую активность. Такое поведение не было столь заметным у крыс. Чайные шарики обеспечивают вентилируемую оболочку полотенца, давая полный доступ к запаху, оставаясь защищенными в течение всего экспериментального испытания. Эти чайные шарики могут быть продезинфицированы в соответствии с протоколами использования животных, приготовлены и введены непосредственно после операции, чтобы начать приучать животных к структуре вместе с контрольным стимулом. Мыши могут затем жить с дополнительным обогащением, уменьшая значимость острого представления стимула.

Привыкание к присутствию чайного шарика является лишь одним из аспектов привыкания, который имеет решающее значение для этого метода. Описанный протокол привыкания также состоит из повторного воздействия процедуры тестирования для нормализации испытательной среды (т.е. персонала, транспортировки и перемещения к месту тестирования, воздействия стимула). Это расширенное привыкание сводит к минимуму нюансированные реакции животных и фокусирует измерения на желаемых зависимых переменных (например, фармакологических или контекстуальных стимулах). Предыдущая оценка этого протокола определила четыре испытания в качестве минимального количества привычек, необходимых перед температурным тестированием в домашних клетках у крыс⁸. Если тестирование разделено длительными периодами (более 2-3 недель), животные должны быть повторно приучены. Для повторного привыкания достаточно как минимум одного-двух испытаний. Однако, если температурные тесты разделены более длительными приступами времени, может потребоваться повторение большего количества испытаний.

В постоянных усилиях по приучению мышей и крыс к процедуре тестирования в каждое экспериментальное испытание должен быть включен период акклиматизации перед представлением стимула. Это время акклиматизации имеет решающее значение для восстановления баланса температуры и активности после перемещения в место тестирования. Грызуны, как правило, имеют резкое повышение температуры из-за транслокации. Акклиматизация должна состоять минимум из 1 ч без взаимодействия со стороны экспериментатора в день тестирования перед любым добавлением фармакологического средства или контекстуальных стимулов. Это необходимо каждый день тестирования.

В описанных тестах температуры домашней клетки мыши имеют свободный диапазон своей домашней клетки, чтобы бродить в ответ на тестируемый стимул. Это может вызвать переменные сдвиги в активности, влияющие на точность показаний температуры и, следовательно, на анализ термогенных эффектов независимой переменной (например, фармакологического или контекстуального стимула). В знак признания потенциальных изменений температуры из-за уровня активности ниже включен протокол, описывающий использование температуры во время ходьбы на беговой дорожке. Опубликованная литература описывает успешное использование этой процедуры у крыс, и в настоящее время она используется с^мышами 8,10,14,15. Ходьба на беговой дорожке поддерживает постоянную скорость активности для испытуемого. Для этого исследования беговые дорожки строго используются для контроля уровня активности и, следовательно, устанавливаются на самую низкую доступную скорость на беговой дорожке, чтобы способствовать ходьбе для мышей и аналогично низкую настройку для крыс.

Следующая процедура описана для измерения температуры односторонней икроножной железы у мышей и проявления запаха хищника. Конструкция может быть использована в сочетании с фармакологическими агентами и переносится на крыс и другие группы скелетных мышц (т.е. квадрицепсы) у мышей. Для крыс транспондеры могут быть помещены в икроножную мышцу двусторонне и в коричневую жировую ткань. Из-за ограничений по размеру и расстоянию на мышь можно использовать только один транспондер. Незначительные изменения (например, удаление контекстуальных стимулов) могут быть сделаны для оценки термогенных реакций на фармакологические агенты.