Messung der Thermogenese der Skelettmuskulatur bei Mäusen und Ratten

Innerhalb der Stoffwechselforschung ist die Untersuchung der Thermogenese der Skelettmuskulatur ein vielversprechender neuer Weg, um die Homöostase des Körpergewichts zu untersuchen. Die veröffentlichte Literatur unterstützt die Idee, dass die thermogenen Reaktionen eines der größten Organsysteme des Körpers – der Skelettmuskulatur – einen Weg zur Erhöhung des Energieverbrauchs und anderer metabolischer Effekte bieten, wodurch Systeme innerhalb von Krankheiten wie Fettleibigkeit effektiv wieder ins Gleichgewicht gebracht^werden 1,2,3. Wenn der Muskel als thermogenes Organ betrachtet werden kann, müssen Studien eine praktische Methodik verwenden, um thermogene Veränderungen innerhalb dieses Organs zu untersuchen. Der Wunsch, die endothermen Auswirkungen der Skelettmuskulatur zu verstehen, und der Nutzen dieser Methodik zur Untersuchung der Thermogenese nicht zitternder Muskeln sind nicht spezifisch für metabolische Studien. Disziplinen wie Evolution⁴, vergleichende Physiologie⁵ und Ökophysiologie^6,7 haben ein persönliches Interesse daran gezeigt^, zu verstehen, wie die Muskelthermogenese zur Endothermie beitragen kann und wie sich dieser Mechanismus an die Umwelt anpasst. Das vorgestellte Protokoll bietet die kritischen Methoden, die zur Beantwortung dieser Fragen erforderlich sind.

Die bereitgestellte Methode kann bei der Bewertung der kontextuellen und pharmakologischen Stimulimodulation der Muskeltemperatur verwendet werden, einschließlich der einzigartigen Technik der Bereitstellung von Raubtiergeruch (PO), um den Kontext zu verschieben, um die Bedrohung durch Raubtiere zu replizieren. Frühere Berichte haben die Fähigkeit von PO gezeigt, schnell einen beträchtlichen Anstieg der Muskelthermogenese zu induzieren⁸. Darüber hinaus können pharmakologische Reize auch die Muskeltemperatur verändern. Dies wurde im Zusammenhang mit der PO-induzierten Muskelthermogenese gezeigt, bei der die pharmakologische Blockade peripherer β-adrenerger Rezeptoren unter Verwendung von Nadolol die Fähigkeit von PO hemmte, die Muskelthermogenese zu induzieren, ohne die kontraktile Thermogenese während des Laufbandgehens signifikant zu beeinflussen⁸. Die zentrale Verabreichung von Melanocortin-Rezeptor-Agonisten bei Ratten wurde auch verwendet, um Gehirnmechanismen zu erkennen, die die Thermogenese verändern ^9,10.

Hier ist eine vorläufige Untersuchung der Fähigkeit des Neurohormons Oxytocin (Oxt), die Muskelthermogenese bei Mäusen zu verändern. Ähnlich wie bei der Bedrohung durch Raubtiere erhöhen soziale Begegnungen mit einem gleichgeschlechtlichen Artgenossen die Körpertemperatur, ein Phänomen, das als soziale Hyperthermie bezeichnet^{wird 11}. Angesichts der Relevanz von Oxt für das Sozialverhalten¹² wurde spekuliert, dass Oxt ein Vermittler der sozialen Hyperthermie bei Mäusen ist. Tatsächlich verringert ein Oxytocin-Rezeptor-Antagonist die soziale Hyperthermie bei Mäusen¹¹, und Mäusewelpen, denen Oxt fehlt, zeigen Defizite in Verhaltens- und physiologischen Aspekten der Thermoregulation, einschließlich Thermogenese¹³. Angesichts der Tatsache, dass Harshaw et al. (2021) keine Beweise für die β3-adrenerge rezeptorabhängige Thermogenese des braunen Fettgewebes (BAT) mit sozialer Hyperthermie¹¹ gefunden haben, wurde postuliert, dass soziale Hyperthermie durch Oxts Induktion der Muskelthermogenese angetrieben werden könnte.

Um die Thermogenese der Skelettmuskulatur zu messen, verwendet das folgende Protokoll die Implantation von vorprogrammierten IPTT-300-Transpondern neben dem interessierenden Muskel innerhalb einer Maus oder Ratte 8,10,14,15. Bei diesen Transpondern handelt es sich um glasgekapselte Mikrochips, die mit entsprechenden Transponderlesern ausgelesen werden. Wenig bis gar keine Forschung hat diese Technologie in dieser Eigenschaft eingesetzt, obwohl Studien auf die Notwendigkeit der Spezifität dieser Methode hindeuten^16,17. Frühere Untersuchungen haben die Zuverlässigkeit dieses Verfahrens und eine Vielzahl von Möglichkeiten gezeigt, wie Temperaturtransponder im Vergleich zu anderen Temperaturprüfverfahren¹⁸ oder in Verbindung mit chirurgischen Verfahren (z. B. Kanülierung¹⁹) verwendet werden können. Studien dieser Art stützen sich jedoch auf verschiedene strategische Platzierungen, um die Gesamtkörpertemperatur^20,21,22 oder spezifizierte Gewebe wie BAT^23,24,25 zu messen.

Anstatt die Temperatur von diesen Stellen oder unter Verwendung von Ohr- oder Rektalthermometern²⁶ zu messen, bietet das hier beschriebene Verfahren Spezifität für den interessierenden Muskel. Die Fähigkeit, eine Stelle durch direkte Implantation von Transpondern in der Nähe der interessierenden Muskeln anzugreifen, ist effektiver, um die Muskelthermogenese gezielt zu untersuchen. Es bietet einen neuen Weg zusätzlich zu denen, die die Oberflächeninfrarot-Thermometrie ^27,28 oder die Hauttemperaturmessungen über Thermoelement ²⁹ bieten. Darüber hinaus bieten die durch diese Methode gelieferten Daten eine Reihe von Forschungsmöglichkeiten, wodurch die Notwendigkeit großer, teurer High-Tech-Geräte und Software wie Infrarot-Thermografie 30,31,32 vermieden wird.

Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um die Temperatur im Quadrizeps und Gastrocnemius entweder einseitig oder bilateral zu messen. Diese Methode hat sich auch in Verbindung mit der stereotaktischen Chirurgie als wirksam erwiesen^14,15. Innerhalb von ~7-10 cm des Transpondergliedes werden tragbare Transponderleser (DAS-8027/DAS-7007R) zum Scannen, Messen und Anzeigen der Temperatur verwendet. Dieser Abstand war für frühere Untersuchungen kritisch und wertvoll ^8,9,10, da er potenzielle Stressoren und temperaturverändernde Variablen wie den Umgang mit Tieren während der Testverfahren minimiert. Mithilfe von Zeitschaltuhren können dann Messungen aufgezeichnet und über einen längeren Zeitraum ohne direkte Interaktion mit den Tieren gesammelt werden.

Um die Störung von Mäusen während des Tests weiter zu minimieren, beschreibt diese Methode die Montage und Verwendung von Steigleitungen aus PVC-Rohrleitungen, um dem Experimentator während der Prüfung Zugang zum Boden der Heimkäfige zu geben. Mit den Tragegurten in Verbindung mit dem digitalen Lesegerät können Temperaturmessungen der Transpondergliedmaße ohne tierische Interaktion nach dem Setzen des Stimulus durchgeführt werden. Zu minimalen Kosten kann diese Methode in Verbindung mit pharmakologischen und kontextuellen Stimuli verwendet werden, was sie für Forscher leicht zugänglich macht. Darüber hinaus kann diese Methode mit einer beträchtlichen Anzahl von Probanden (~ 16 Mäuse oder ~ 12 Ratten) gleichzeitig angewendet werden, was Zeit spart, um den Gesamtdurchsatz für jedes Forschungsprojekt zu erhöhen.

Bei dieser Methode wird ein handgefertigter Mechanismus zur Darstellung von Gerüchen an Mäuse mit Edelstahl-Mesh-Tee-Infuser-Bällen eingeführt, die von nun an als “Teekugeln” bezeichnet werden. Obwohl diese Teebällchen ideal sind, um Geruchsmaterial zu enthalten, werden in diesen Studien Handtücher, die über 2-3 Wochen als Einstreu im Käfig für Frettchen, ein natürliches Raubtier von Mäusen und Ratten, dienten, in jede Behandlung Teeball gelegt. Jedes Handtuch wird in Quadrate von 5 cm x 5 cm geschnitten. Diese Aliquotierung wiederholt sich auch bei ansonsten identischen geruchlosen Kontrolltüchern. Die Präsentation dieser Gerüche ohne Barriere (z. B. Teeball) führte dazu, dass Mäuse die Fasern in ihren Käfigen zerkleinerten und die körperliche Aktivität erhöhten. Dieses Verhalten war bei Ratten nicht so auffällig. Teekugeln bieten eine belüftete Hülle für das Handtuch, die vollen Zugang zum Geruch bietet, während sie für die gesamte experimentelle Studie geschützt bleiben. Diese Teebällchen können in Übereinstimmung mit den Tierverwendungsprotokollen desinfiziert, vorbereitet und direkt nach der Operation eingeführt werden, um die Tiere zusammen mit dem Kontrollreiz an die Struktur zu gewöhnen. Mäuse können dann mit der zusätzlichen Bereicherung leben, wodurch die Bedeutung der akuten Reizpräsentation verringert wird.

Die Gewöhnung an das Vorhandensein des Teeballs ist nur ein Aspekt der Gewöhnung, der für diese Methode entscheidend ist. Das beschriebene Gewöhnungsprotokoll besteht auch aus wiederholter Exposition gegenüber dem Testverfahren, um die Testumgebung zu normalisieren (d.h. Personal, Transport und Bewegung zum Testort, Exposition gegenüber Reizen). Diese erweiterte Gewöhnung minimiert nuancierte Reaktionen der Tiere und fokussiert die Messungen auf die gewünschten abhängigen Variablen (z. B. pharmakologische oder kontextuelle Reize). Frühere Bewertungen dieses Protokolls haben vier Studien als die Mindestanzahl von Gewöhnungen identifiziert, die vor Temperaturtests in Heimkäfigen bei Ratten erforderlich sind⁸. Wenn die Prüfung durch lange Zeiträume (mehr als 2-3 Wochen) getrennt ist, müssen die Tiere wieder gewöhnt werden. Bei wiederholter Gewöhnung sind mindestens ein bis zwei Versuche ausreichend. Wenn Temperaturtests jedoch durch längere Zeitabschnitte getrennt werden, kann eine Wiederholung weiterer Versuche erforderlich sein.

In den fortgesetzten Bemühungen, Mäuse und Ratten an das Testverfahren zu gewöhnen, sollte in jeder experimentellen Studie eine Akklimatisierungsphase vor der Präsentation des Stimulus enthalten sein. Diese Akklimatisierungszeit ist entscheidend, um Temperatur und Aktivität nach der Verlagerung an den Testort wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Nagetiere neigen dazu, aufgrund von Translokation stark zu temperaturerhöhungen. Die Akklimatisierung sollte aus mindestens 1 h ohne Interaktion des Experimentators am Testtag bestehen, bevor ein pharmakologischer Wirkstoff oder kontextuelle Stimuli hinzugefügt werden. Dies ist an jedem Testtag notwendig.

In den skizzierten Hauskäfig-Temperaturtests haben Mäuse die freie Reichweite ihres Heimkäfigs, um sich als Reaktion auf den getesteten Reiz zu bewegen. Dies kann zu variablen Aktivitätsverschiebungen führen, die sich auf die Genauigkeit der Temperaturmessungen und damit auf die Analyse der thermogenen Effekte der unabhängigen Variablen (z. B. pharmakologischer oder kontextueller Stimulus) auswirken. In Anerkennung der möglichen Temperaturänderungen aufgrund des Aktivitätsniveaus ist unten ein Protokoll enthalten, das die Verwendung der Temperatur während des Laufbandgehens beschreibt. Die veröffentlichte Literatur beschreibt den erfolgreichen Einsatz dieses Verfahrens bei Ratten, und es wird derzeit mit Mäusen 8,10,14,15 angewendet. Das Laufband hält eine konstante Aktivitätsgeschwindigkeit für die Testperson aufrecht. Für diese Studie werden Laufbänder ausschließlich zur Kontrolle des Aktivitätsniveaus verwendet und daher auf die niedrigste verfügbare Geschwindigkeit auf dem Laufband eingestellt, um das Gehen für Mäuse und eine ähnlich niedrige Einstellung für Ratten zu fördern.

Das folgende Verfahren wird für die Temperaturmessung von einseitigem Gastrocnemius bei Mäusen und Raubtiergeruch beschrieben. Das Design kann in Verbindung mit pharmakologischen Wirkstoffen verwendet werden und ist auf Ratten und andere Skelettmuskelgruppen (z. B. Quadrizeps) in Mäusen übertragbar. Bei Ratten können Transponder bilateral im Gastrocnemius und im braunen Fettgewebe platziert werden. Aufgrund von Größen- und Entfernungsbeschränkungen kann nur ein Transponder pro Maus verwendet werden. Geringfügige Modifikationen (z. B. die Entfernung kontextueller Reize) können vorgenommen werden, um thermogene Reaktionen auf pharmakologische Wirkstoffe zu beurteilen.