Het meten van de thermogenese van de skeletspieren bij muizen en ratten

Binnen metabolisch onderzoek is het onderzoek van de thermogenese van de skeletspieren een veelbelovende nieuwe weg voor het onderzoeken van homeostase van het lichaamsgewicht. De gepubliceerde literatuur ondersteunt het idee dat de thermogene reacties van een van de grootste orgaansystemen van het lichaam – de skeletspieren – een manier bieden om het energieverbruik en andere metabole effecten te verhogen, waardoor effectief herbalanceringssystemen binnen ziekten zoals obesitas^{worden hersteld 1,2,3}. Als de spier als een thermogeen orgaan kan worden beschouwd, moeten studies een praktische methodologie gebruiken om thermogene veranderingen in dit orgaan te bestuderen. De wens om de endotherme impact van skeletspieren te begrijpen en het nut van deze methodologie voor het bestuderen van niet-rillende spierthermogenese zijn niet specifiek voor metabole studies. Disciplines zoals evolutie⁴, vergelijkende fysiologie⁵ en ecofysiologie ^6,7 hebben een gevestigd belang getoond in het begrijpen van de manieren waarop spierthermogenese kan bijdragen aan endothermie en hoe dit mechanisme zich aanpast aan de omgeving. Het gepresenteerde protocol biedt de kritieke methoden die nodig zijn om deze vragen aan te pakken.

De verstrekte methode kan worden gebruikt bij de beoordeling van zowel contextuele als farmacologische stimulimodulatie van spiertemperatuur, inclusief de unieke techniek van het verstrekken van roofdiergeur (PO) om de context te verschuiven om roofdierdreiging te repliceren. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat PO snel een aanzienlijke toename van spierthermogenese kan induceren⁸. Bovendien kunnen farmacologische stimuli ook de spiertemperatuur veranderen. Dit is aangetoond in de context van PO-geïnduceerde spierthermogenese, waarbij farmacologische blokkade van perifere β-adrenerge receptoren, met behulp van nadolol, het vermogen van PO om spierthermogenese te induceren remde zonder de contractiele thermogenese tijdens het lopen op de loopband significant te beïnvloeden⁸. Centrale toediening van melanocortinereceptoragonisten bij ratten is ook gebruikt om hersenmechanismen te onderscheiden die de thermogenese veranderen ^9,10.

Hier is een voorlopig onderzoek naar het vermogen van het neurohormoon oxytocine (Oxt) om de spierthermogenese bij muizen te veranderen. Net als bij roofdierdreiging verhogen sociale ontmoetingen met een conspecifiek van hetzelfde geslacht de lichaamstemperatuur, een fenomeen dat sociale hyperthermie wordt genoemd¹¹. Gezien de relevantie van Oxt voor sociaal gedrag¹², is er gespeculeerd dat Oxt een mediator is van sociale hyperthermie bij muizen. Inderdaad, een oxytocinereceptorantagonist vermindert sociale hyperthermie bij muizen¹¹, en muizenpups zonder Oxt vertonen tekorten in gedrags- en fysiologische aspecten van thermoregulatie, waaronder thermogenese¹³. Gezien het feit dat Harshaw et al. (2021) geen bewijs hebben gevonden dat β3 adrenerge receptorafhankelijke bruine vetweefsel (BAT) thermogenese met sociale hyperthermie¹¹ ondersteunt, is gesteld dat sociale hyperthermie kan worden aangedreven door Oxt’s inductie van spierthermogenese.

Om de thermogenese van de skeletspieren te meten, gebruikt het volgende protocol de implantatie van voorgeprogrammeerde IPTT-300-transponders naast de spier van belang in een muis of rat 8,10,14,15. Deze transponders zijn in glas ingekapselde microchips die worden gelezen met behulp van overeenkomstige transponderlezers. Weinig tot geen onderzoek heeft deze technologie in deze hoedanigheid gebruikt, hoewel studies hebben gesuggereerd dat de specificiteit van deze methode nodig is^16,17. Eerdere onderzoeken hebben de betrouwbaarheid van deze methode aangetoond en een verscheidenheid aan manieren waarop temperatuurtransponders kunnen worden gebruikt in vergelijking met andere temperatuurtestmethoden¹⁸ of in combinatie met chirurgische methoden (bijv. Cannulatie¹⁹). Studies van deze aard zijn echter gebaseerd op verschillende strategische plaatsingen om de totale lichaamstemperatuur ^20,21,22 of gespecificeerde weefsels zoals BBT ^23,24,25 te meten.

In plaats van de temperatuur vanaf deze locaties te meten of tijdens het gebruik van oor- of rectale thermometers²⁶, biedt de hier beschreven methode specificiteit voor de spier van belang. Het vermogen om een site te targeten door transponders direct naast de spieren van belang te implanteren, is effectiever voor het specifiek onderzoeken van spierthermogenese. Het biedt een nieuwe weg naast die van oppervlakte-infraroodthermometrie^27,28 of cutane temperatuurmetingen via thermokoppel²⁹. Bovendien bieden de gegevens die via deze methode worden verstrekt een reeks onderzoeksmogelijkheden, waardoor de noodzaak van grote, dure, hightech apparatuur en software zoals infraroodthermografie ^30,31,32 wordt vermeden.

Deze methode is met succes gebruikt om de temperatuur in de quadriceps en gastrocnemius te meten, hetzij unilateraal of bilateraal. Deze methode is ook effectief geweest in combinatie met stereotaxische chirurgie ^14,15. Binnen ~ 7-10 cm van de transponderpoot worden draagbare transponderlezers (DAS-8027 / DAS-7007R) gebruikt om de temperatuur te scannen, te meten en weer te geven. Deze afstand is van cruciaal belang en waardevol geweest voor eerdere onderzoeken ^8,9,10 omdat het potentiële stressoren en temperatuurveranderende variabelen zoals dierbehandeling tijdens de testprocedures minimaliseert. Met behulp van timers kunnen metingen vervolgens worden geregistreerd en verzameld over een bepaalde periode zonder directe interactie met de dieren.

Om de verstoring van muizen tijdens het testen verder te minimaliseren, beschrijft deze methode de assemblage en het gebruik van risers gemaakt van PVC-leidingen om de experimentator tijdens het testen toegang te geven tot de bodem van de thuiskooien. Met behulp van de risers in combinatie met de digitale lezer kunnen temperatuurmetingen van de transponderpoot worden uitgevoerd zonder enige dierlijke interactie nadat de stimulus is geplaatst. Tegen minimale kosten kan deze methode worden gebruikt in combinatie met farmacologische en contextuele stimuli, waardoor deze vrij toegankelijk is voor onderzoekers. Bovendien kan deze methode worden gebruikt met een aanzienlijk aantal proefpersonen (~ 16 muizen of ~ 12 ratten) tegelijk, waardoor tijd wordt bespaard bij het verhogen van de totale doorvoer voor elk onderzoeksproject.

Geïntroduceerd in deze methode is een vervaardigd mechanisme voor het presenteren van geuren aan muizen met behulp van roestvrijstalen mesh thee-infuserballen, vanaf nu aangeduid als “theeballen”. Hoewel deze theeballen ideaal zijn voor het bevatten van geurmateriaal, worden in deze studies handdoeken die gedurende 2-3 weken als in-cage bedding dienden voor fretten, een natuurlijk roofdier van muizen en ratten, in elke behandeling theebal geplaatst. Elke handdoek wordt in vierkanten van 5 cm x 5 cm gesneden. Deze aliquoting wordt ook herhaald met verder identieke geurloze controlehanddoeken. Het presenteren van deze geuren zonder een barrière (d.w.z. theebal) leidde ertoe dat muizen de vezels in hun kooien versnipperden, waardoor de fysieke activiteit toenam. Dit gedrag was niet zo opvallend bij ratten. Theeballen bieden een geventileerde behuizing aan de handdoek, waardoor volledige toegang tot de geur wordt gegeven terwijl ze gedurende de hele experimentele proef beschermd blijven. Deze theeballen kunnen worden ontsmet in overeenstemming met de protocollen voor dierlijk gebruik, worden voorbereid en direct na de operatie worden geïntroduceerd om te beginnen met het wennen van de dieren aan de structuur, samen met de controleprikkel. Muizen kunnen dan leven met de extra verrijking, waardoor de salience van de acute stimuluspresentatie afneemt.

Gewenning aan de aanwezigheid van de theebal is slechts één aspect van gewenning dat van cruciaal belang is voor deze methode. Het beschreven gewenningsprotocol bestaat ook uit herhaalde blootstelling aan de testprocedure om de testomgeving te normaliseren (d.w.z. personeel, transport en beweging naar de testlocatie, blootstelling aan stimulus). Deze uitgebreide gewenning minimaliseert genuanceerde reacties van de dieren en richt metingen op de gewenste afhankelijke variabelen (bijvoorbeeld farmacologische of contextuele stimuli). Eerdere beoordeling van dit protocol heeft vier proeven geïdentificeerd als het minimumaantal gewenningsen dat nodig is voor temperatuurtests in thuiskooien bij ratten⁸. Als het testen wordt gescheiden door lange perioden (meer dan 2-3 weken), moeten de dieren opnieuw worden gewend. Voor herhaalde gewenning is minimaal één tot twee proeven voldoende. Als temperatuurtests echter worden gescheiden door langere perioden, kan het nodig zijn om meer onderzoeken te herhalen.

In de voortdurende inspanning om muizen en ratten aan de testprocedure te laten wennen, moet in elke experimentele proef een acclimatisatieperiode vóór de presentatie van de stimulus worden opgenomen. Deze acclimatisatietijd is van cruciaal belang om temperatuur en activiteit opnieuw in evenwicht te brengen nadat deze naar de testlocatie is verplaatst. Knaagdieren hebben de neiging om sterke temperatuurstijgingen te hebben als gevolg van translocatie. Acclimatisatie moet bestaan uit minimaal 1 uur zonder interactie van de experimentator op de dag van het testen voordat een farmacologisch agens of contextuele stimuli worden toegevoegd. Dit is elke testdag nodig.

In de geschetste thuiskooitemperatuurtests hebben muizen het vrije bereik van hun thuiskooi om rond te zwerven als reactie op de geteste stimulus. Dit kan variabele verschuivingen in activiteit veroorzaken, die van invloed zijn op de nauwkeurigheid van temperatuurmetingen en dus op de analyse van de thermogene effecten van de onafhankelijke variabele (bijv. Farmacologische of contextuele stimulus). Als erkenning van de mogelijke veranderingen in temperatuur als gevolg van het activiteitsniveau, is hieronder een protocol opgenomen dat het gebruik van temperatuur tijdens het lopen op de loopband beschrijft. De gepubliceerde literatuur beschrijft het succesvolle gebruik van deze procedure bij ratten en wordt momenteel gebruikt bij muizen 8,10,14,15. Loopbandlopen handhaaft een constante snelheid van activiteit voor de proefpersoon. Voor deze studie worden loopbanden strikt gebruikt om het activiteitsniveau te controleren en daarom zijn ze ingesteld op de laagst beschikbare snelheid op de loopband om het lopen voor muizen en een vergelijkbare lage instelling voor ratten te bevorderen.

De volgende procedure wordt beschreven voor de temperatuurmeting van unilaterale gastrocnemius bij muizen en roofdiergeurpresentatie. Het ontwerp kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische middelen en is overdraagbaar op ratten en andere skeletspiergroepen (d.w.z. quadriceps) bij muizen. Voor ratten kunnen transponders bilateraal in de gastrocnemius en in bruin vetweefsel worden geplaatst. Vanwege grootte- en afstandsbeperkingen kan slechts één transponder per muis worden gebruikt. Kleine wijzigingen (bijvoorbeeld het verwijderen van contextuele stimuli) kunnen worden aangebracht om thermogene reacties op farmacologische middelen te beoordelen.