يتم زرع الفئران والجرذان جراحيا باستخدام أجهزة الإرسال والاستقبال عن بعد ثم تعويدها على بيئة الاختبار والإجراء. يتم قياس التغيرات في درجة حرارة العضلات استجابة للمنبهات الدوائية أو السياقية في القفص المنزلي أو أثناء النشاط البدني الموصوف (أي المشي على جهاز المشي بسرعة ثابتة).
يوفر التوليد الحراري للعضلات الهيكلية وسيلة محتملة لفهم التوازن الأيضي بشكل أفضل والآليات الكامنة وراء إنفاق الطاقة. من المثير للدهشة أن القليل من الأدلة المتاحة لربط الآليات العصبية والعضلية الخلوية والجزيئية لتوليد الحرارة مباشرة بالتغيرات القابلة للقياس في درجة حرارة العضلات. تصف هذه الورقة طريقة يتم من خلالها استخدام أجهزة الإرسال والاستقبال لدرجة الحرارة لاسترداد القياسات المباشرة لدرجة حرارة العضلات الهيكلية للفأر والفئران.
يتم زرع أجهزة الإرسال والاستقبال عن بعد جراحيا داخل عضلات الفئران والجرذان ، ويتم منح الحيوانات وقتا للتعافي. يجب بعد ذلك تعويد الفئران والجرذان بشكل متكرر على بيئة الاختبار والإجراء. يتم قياس التغيرات في درجة حرارة العضلات استجابة للمنبهات الدوائية أو السياقية في قفص المنزل. يمكن أيضا قياس درجة حرارة العضلات أثناء النشاط البدني الموصوف (أي المشي على جهاز المشي بسرعة ثابتة) لتحليل التغيرات في النشاط كمساهمين في التغيرات في درجة حرارة العضلات التي تسببها هذه المحفزات.
تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لتوضيح الآليات الكامنة وراء التحكم الحراري للعضلات على مستوى الدماغ والجهاز العصبي الودي والعضلات الهيكلية. يتم تقديم عروض توضيحية لهذا النجاح باستخدام رائحة المفترس (PO ؛ رائحة النمس) كحافز سياقي وحقن الأوكسيتوسين (Oxt) كحافز دوائي ، حيث تحفز رائحة المفترس توليد الحرارة العضلية ، و Oxt يثبط درجة حرارة العضلات. وبالتالي ، تعرض مجموعات البيانات هذه فعالية هذه الطريقة في اكتشاف التغيرات السريعة في درجة حرارة العضلات.
ضمن أبحاث التمثيل الغذائي ، يعد فحص توليد الحرارة للعضلات الهيكلية وسيلة جديدة واعدة لفحص توازن وزن الجسم. تدعم الأدبيات المنشورة فكرة أن الاستجابات الحرارية لأحد أكبر أجهزة الجسم – العضلات الهيكلية – توفر وسيلة لزيادة نفقات الطاقة والتأثيرات الأيضية الأخرى ، وبالتالي إعادة توازن الأنظمة بشكل فعال داخل أمراض مثل السمنة1،2،3. إذا كان من الممكن اعتبار العضلات عضوا حراريا ، فيجب أن تستخدم الدراسات منهجية عملية لدراسة التغيرات الحرارية داخل هذا العضو. الرغبة في فهم التأثير الماص للحرارة للعضلات الهيكلية وفائدة هذه المنهجية لدراسة توليد الحرارة للعضلات غير المرتعشة ليست خاصة بالدراسات الأيضية. أظهرت التخصصات بما في ذلك التطور4 وعلم وظائف الأعضاء المقارن5 والفيزيولوجيا البيئية6،7 اهتماما راسخا بفهم الطرق التي قد يساهم بها توليد الحرارة العضلي في ماص الحرارة وكيف تتكيف هذه الآلية مع البيئة. يوفر البروتوكول المقدم الأساليب الحاسمة اللازمة لمعالجة هذه الأسئلة.
يمكن استخدام الطريقة المقدمة في تقييم كل من تعديل المحفزات السياقية والدوائية لدرجة حرارة العضلات ، بما في ذلك التقنية الفريدة لتوفير رائحة المفترس (PO) لتغيير السياق لتكرار تهديد المفترس. أظهرت التقارير السابقة قدرة PO على إحداث زيادة كبيرة في توليد الحرارةالعضلي 8 بسرعة. علاوة على ذلك ، يمكن للمحفزات الدوائية أيضا تغيير درجة حرارة العضلات. وقد ثبت ذلك في سياق توليد الحرارة العضلي الناجم عن PO ، حيث أدى الحصار الدوائي للمستقبلات β الأدرينالية المحيطية ، باستخدام nadolol ، إلى تثبيط قدرة PO على تحفيز توليد الحرارة العضلي دون التأثير بشكل كبير على توليد الحرارة المقلص أثناء المشي على جهاز المشي8. كما تم استخدام الإدارة المركزية لمنبهات مستقبلات الميلانوكورتين في الفئران لتمييز آليات الدماغ التي تغير توليد الحرارة 9,10.
يتم توفير هنا تحقيقا أوليا في قدرة هرمون الأوكسيتوسين العصبي (Oxt) على تغيير توليد الحرارة العضلي في الفئران. على غرار تهديد المفترس ، تؤدي اللقاءات الاجتماعية مع شخص محدد من نفس الجنس إلى زيادة درجة حرارة الجسم ، وهي ظاهرة يشار إليها باسم ارتفاع الحرارة الاجتماعي11. نظرا لأهمية Oxt للسلوك الاجتماعي12 ، فقد تم التكهن بأن Oxt هو وسيط لارتفاع الحرارة الاجتماعي في الفئران. في الواقع ، يقلل مضاد مستقبلات الأوكسيتوسين من ارتفاع الحرارة الاجتماعي في الفئران11 ، وتظهر جراء الفئران التي تفتقر إلى Oxt عجزا في الجوانب السلوكية والفسيولوجية للتنظيم الحراري ، بما في ذلك توليد الحرارة13. بالنظر إلى أن Harshaw et al. (2021) لم يجد دليلا يدعم توليد الحرارة للأنسجة الدهنية البنية (BAT) المعتمدة على مستقبلات الأدرينالية β3 مع ارتفاع الحرارة الاجتماعي11 ، فقد افترض أن ارتفاع الحرارة الاجتماعي قد يكون مدفوعا بتحريض أوكست لتوليد الحرارة العضلي.
لقياس التوليد الحراري للعضلات الهيكلية ، يستخدم البروتوكول التالي زرع أجهزة الإرسال والاستقبال IPTT-300 المبرمجة مسبقا بجوار العضلات محل الاهتمام داخل الفأر أو الجرذ8،10،14،15. أجهزة الإرسال والاستقبال هذه عبارة عن رقائق دقيقة مغلفة بالزجاج تتم قراءتها باستخدام قارئات جهاز الإرسال والاستقبال المقابلة. استخدمت الأبحاث القليلة أو المعدومة هذه التقنية بهذه الصفة ، على الرغم من أن الدراسات أشارت إلى الحاجة إلى الخصوصية التي توفرها هذه الطريقة16,17. أظهرت التحقيقات السابقة موثوقية هذه الطريقة ومجموعة متنوعة من الطرق التي يمكن من خلالها استخدام أجهزة الإرسال والاستقبال في درجة الحرارة مقارنة بطرق اختبار درجة الحرارة الأخرى18 أو بالاقتران مع الطرق الجراحية (على سبيل المثال ، القنية19). ومع ذلك ، تعتمد الدراسات من هذا النوع على مواضع استراتيجية مختلفة لقياس درجة حرارة الجسم الكلية 20،21،22 أو أنسجة محددة مثل BAT23،24،25.
بدلا من قياس درجة الحرارة من هذه المواقع أو أثناء استخدام موازين حرارة الأذن أو المستقيم26 ، توفر الطريقة الموضحة هنا خصوصية للعضلة محل الاهتمام. تعد القدرة على استهداف موقع ما عن طريق زرع أجهزة إرسال واستقبال مباشرة مجاورة للعضلات محل الاهتمام أكثر فعالية لفحص توليد الحرارة العضلي على وجه التحديد. يوفر طريقا جديدا بالإضافة إلى تلك التي يوفرها قياس الحرارة بالأشعة تحت الحمراءالسطحية 27,28 أو قياسات درجة الحرارة الجلدية عبر المزدوجة الحرارية 29. علاوة على ذلك ، توفر البيانات المقدمة من خلال هذه الطريقة مجموعة من طرق البحث ، وتجنب الحاجة إلى معدات وبرامج كبيرة ومكلفة وعالية التقنية مثل التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء30،31،32.
تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لقياس درجة الحرارة في عضلات الفخذ والساق ، إما من جانب واحد أو ثنائي. كانت هذه الطريقة فعالة أيضا بالتزامن مع الجراحة التجسيمية14،15. ضمن ~ 7-10 سم من طرف جهاز الإرسال والاستقبال ، يتم استخدام قارئات جهاز الإرسال والاستقبال المحمولة (DAS-8027 / DAS-7007R) لمسح درجة الحرارة وقياسها وعرضها. كانت هذه المسافة حرجة وقيمة للتحقيقات السابقة8،9،10 لأنها تقلل من الضغوطات المحتملة والمتغيرات المتغيرة لدرجة الحرارة مثل التعامل مع الحيوانات أثناء إجراءات الاختبار. باستخدام أجهزة ضبط الوقت ، يمكن بعد ذلك تسجيل القياسات وجمعها على مدار فترة زمنية دون تفاعل مباشر مع الحيوانات.
لتقليل إزعاج الفئران أثناء الاختبار ، تصف هذه الطريقة تجميع واستخدام الناهضين المصنوع من أنابيب PVC لمنح المجرب إمكانية الوصول إلى قاع الأقفاص المنزلية أثناء الاختبار. باستخدام الناهضين جنبا إلى جنب مع القارئ الرقمي ، يمكن إجراء قياسات درجة حرارة طرف جهاز الإرسال والاستقبال دون أي تفاعل حيواني بعد وضع التحفيز. بأقل تكلفة ، يمكن استخدام هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع المحفزات الدوائية والسياقية ، مما يجعلها في متناول الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة مع عدد كبير من الموضوعات (~ 16 فأرا أو ~ 12 فأرا) في وقت واحد ، مما يوفر الوقت في زيادة الإنتاجية الإجمالية لأي مشروع بحثي.
تم تقديم آلية مصممة في هذه الطريقة لتقديم الروائح للفئران باستخدام كرات الشاي المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والتي يشار إليها من الآن فصاعدا باسم “كرات الشاي”. على الرغم من أن كرات الشاي هذه مثالية لاحتواء أي مادة ذات رائحة ، في هذه الدراسات ، يتم وضع المناشف التي كانت بمثابة فراش في قفص على مدى 2-3 أسابيع للقوارض ، وهي مفترس طبيعي للفئران والجرذان ، داخل كل كرة شاي علاجية. يتم تقطيع كل منشفة إلى مربعات 5 سم × 5 سم. يتكرر هذا الاقتباس أيضا مع مناشف تحكم متطابقة عديمة الرائحة. أدى تقديم هذه الروائح بدون حاجز (أي كرة الشاي) إلى قيام الفئران بتمزيق الألياف داخل أقفاصها ، مما زاد من النشاط البدني. لم يكن هذا السلوك بارزا في الفئران. توفر كرات الشاي غلافا جيد التهوية للمنشفة ، مما يتيح الوصول الكامل إلى الرائحة مع الحفاظ على الحماية طوال التجربة التجريبية. يمكن تعقيم كرات الشاي هذه وفقا لبروتوكولات استخدام الحيوانات ، وإعدادها وإدخالها مباشرة بعد الجراحة لبدء تعويد الحيوانات على الهيكل جنبا إلى جنب مع حافز التحكم. يمكن للفئران بعد ذلك العيش مع التخصيب الإضافي ، مما يقلل من بروز عرض التحفيز الحاد.
التعود على وجود كرة الشاي هو جانب واحد فقط من التعود الذي يعتبر حاسما لهذه الطريقة. يتكون بروتوكول التعود الموصوف أيضا من التعرض المتكرر لإجراء الاختبار لتطبيع بيئة الاختبار (أي الأفراد والنقل والحركة إلى موقع الاختبار والتعرض للتحفيز). يقلل هذا التعود الممتد من الاستجابات الدقيقة من الحيوانات ويركز القياسات على المتغيرات التابعة المرغوبة (على سبيل المثال ، المحفزات الدوائية أو السياقية). حدد التقييم السابق لهذا البروتوكول أربع تجارب كحد أدنى لعدد الاعتيادات اللازمة قبل اختبار درجة الحرارة داخل الأقفاص المنزلية في الفئران8. إذا تم فصل الاختبار بفترات طويلة (أكثر من 2-3 أسابيع) ، فيجب تعويد الحيوانات مرة أخرى. بالنسبة للتعود المتكرر ، يكفي ما لا يقل عن تجربة أو تجربتين. ومع ذلك ، إذا تم فصل اختبارات درجة الحرارة عن طريق نوبات زمنية أطول ، فقد يكون من الضروري تكرار المزيد من التجارب.
في الجهود المستمرة لتعويد الفئران والجرذان على إجراء الاختبار ، يجب تضمين فترة تأقلم قبل عرض التحفيز في كل تجربة تجريبية. يعد وقت التأقلم هذا أمرا بالغ الأهمية لإعادة توازن درجة الحرارة والنشاط بعد نقله إلى موقع الاختبار. تميل القوارض إلى زيادة حادة في درجات الحرارة بسبب النقل. يجب أن يتكون التأقلم من 1 ساعة على الأقل دون تفاعل من المجرب في يوم الاختبار قبل أي إضافة لعامل دوائي أو محفزات سياقية. هذا ضروري كل يوم من الاختبار.
في اختبارات درجة حرارة القفص المنزلي المحددة ، تتمتع الفئران بالنطاق الحر لقفصها المنزلي للتجول استجابة للتحفيز الذي تم اختباره. يمكن أن يتسبب ذلك في حدوث تحولات متغيرة في النشاط ، مما يؤثر على دقة قراءات درجة الحرارة ، وبالتالي تحليل التأثيرات الحرارية للمتغير المستقل (على سبيل المثال ، التحفيز الدوائي أو السياقي). تقديرا للتغيرات المحتملة في درجة الحرارة بسبب مستوى النشاط ، يتم تضمين بروتوكول أدناه يصف استخدام درجة الحرارة أثناء المشي على جهاز المشي. تصف الأدبيات المنشورة الاستخدام الناجح لهذا الإجراء في الفئران ، ويتم استخدامه حاليا مع الفئران8،10،14،15. يحافظ المشي على جهاز المشي على سرعة ثابتة للنشاط لموضوع الاختبار. في هذه الدراسة ، يتم استخدام أجهزة المشي بشكل صارم للتحكم في مستوى النشاط ، وبالتالي ، يتم ضبطها على أقل سرعة متاحة على جهاز المشي لتعزيز المشي للفئران وإعداد منخفض مماثل للفئران.
تم تحديد الإجراء التالي لقياس درجة حرارة gastrocnemius من جانب واحد في الفئران وعرض رائحة المفترس. يمكن استخدام التصميم جنبا إلى جنب مع العوامل الدوائية ويمكن نقله إلى الفئران ومجموعات العضلات الهيكلية الأخرى (أي عضلات الفخذ) في الفئران. بالنسبة للفئران ، يمكن وضع أجهزة الإرسال والاستقبال في gastrocnemius بشكل ثنائي وفي الأنسجة الدهنية البنية. نظرا لقيود الحجم والمسافة ، يمكن استخدام جهاز إرسال واستقبال واحد فقط لكل ماوس. يمكن إجراء تعديلات طفيفة (على سبيل المثال ، إزالة المحفزات السياقية) لتقييم الاستجابات الحرارية للعوامل الدوائية.
يوفر بروتوكول اختبار درجة الحرارة هذا للحقل وسيلة لقياس توليد الحرارة للعضلات الهيكلية مباشرة. هذا أمر بالغ الأهمية حيث تتعمق الأبحاث في تحديد الآليات الكامنة وراء توليد الحرارة العضلي33. توفر الطريقة بروتوكولين فعالين من حيث التكلفة لقياس توليد الحرارة للعضلات الهيكلية في …
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل مدعوم من قبل R15 DK097644 و R15 DK108668. نشكر الدكتورة شيتانيا ك. جافيني والدكتورة ميغان ريتش على مساهماتهما السابقة والدكتور ستانلي دانيميلر لضمان امتثالنا لإرشادات الاستخدام المؤسسي للحيوانات. شكر خاص للدكتور تيم بارتنيس على تقديم البحوث الأساسية اللازمة لبناء هذه الطريقة والدراسات المرتبطة بها. تم إنشاء الأشكال 1A و C و D والشكل 2A باستخدام Biorender.com.
1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
Heating Pad | |||
Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
Magnetic Strips | Amazon | ||
Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
PVC pipe | |||
Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
Surgical Sheets | |||
Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
Wedge pieces for PVC pipe |